一种基于检测外周血GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒的制作方法

本发明涉及癌症早期筛查技术领域，更具体地，涉及一种基于检测外周血GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒，

背景技术：

在生物个体的生长发育与繁殖过程中，维持遗传物质的稳定性是至关重要的。基因组表观遗传修饰就是其中一种重要的调节方式。主要包括DNA甲基化修饰与核小体中组蛋白的修饰等，使得被修饰DNA的空间结构发生改变或使染色体结构发生改变，导致基因的沉默或过度表达。这两种修饰都是在不改变DNA碱基种类与数量的前提下使生物体表型呈现出多样化。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化在DNA复制起始、错配修复以及转座子的失活等过程中对维持遗传信息的稳定性发挥着重要的作用。

DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNMTs的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。哺乳动物基因组中，DNA甲基化多发生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子。

近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。DNA甲基化在肿瘤中的作用主要表现在以下几个方面：一是甲基化的CpG岛二核苷酸中的胞嘧啶以较高的频率脱氨基变成胸腺嘧啶，造成基因突变；二是抑癌基因和DNA修复基因由于超甲基化而沉默；三是癌基因甲基化水平降低而活化；四是基因组总体甲基化水平降低使转座子、重复序列活化导致染色体稳定性下降。这些因素是导致肿瘤发展、转移、恶化最终导致患者死亡的重要原因。DNA总体甲基化水平(即甲基化谱)和特定基因甲基化程度改变可作为肿瘤诊断指标。但是并没有检测单个基因的DNA甲基化来进行癌症的早期筛查的试剂盒。

技术实现要素：

本发明的一个目的是为了克服现有技术的不足，提供一组用于检测GRP78基因启动子甲基化的甲基化特异性反应的PCR引物。

本发明的第二个目的是提供一种所述的引物组合在制备基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一组用于检测GRP78基因启动子甲基化的甲基化特异性PCR引物组合，包括一对甲基化引物和一对非甲基化引物，甲基化引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示，非甲基化引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示。

所述的甲基化特异性PCR引物组合在制备基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒中的应用。

一种基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒，含有所述的甲基化特异性PCR引物组合。

优选地，还含有甲基化特异性PCR试剂、修饰基因组DNA试剂、脱盐脱磺酸基试剂、外周血白细胞DNA提取试剂和/或DNA纯化试剂。

优选地，甲基化特异性PCR试剂包括：Taq酶，10×含Mg²⁺的PCR缓冲液，dNTP mixture，ddH₂O。

优选地，甲基化特异性PCR试剂的反应体系为：Taq酶0.1μl，10×含Mg²⁺的PCR缓冲液2μl，dNTP mixture 1.6μl，上游引物1μl，下游引物1μl，待测样本DNA 1μl，ddH₂O13.3μl，总计反应体系20μl，其中上游引物和下游引物的浓度为10nM。

优选地，甲基化引物的退火温度为64℃。

优选地，甲基化引物的扩增反应程序为：预变性94℃5分钟，变性94℃30秒，退火64℃30秒，延伸72℃45秒，30个循环反应。

优选地，非甲基化引物的退火温度为61℃。

优选地，非甲基化引物的扩增反应程序为：预变性94℃5分钟，变性94℃30秒，退火61℃30秒，延伸72℃45秒，30个循环反应。

优选地，修饰基因组DNA试剂含有：ddH₂O，NaOH，NaHSO₃，石蜡油，苯二酚(氢醌)。

优选地，脱盐脱磺酸基试剂含有：Tris饱和酚，氯仿，异丙醇，乙醇，TE缓冲液。

优选地，DNA纯化试剂为：蛋白酶K和RNA酶。

甲基化特异性PCR的原理是基于DNA经亚硫酸氢钠处理后，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。基于这种碱基的改变，然后设计针对甲基化和非甲基化序列的一对甲基化引物和一对非甲基化引物，并进行PCR扩增。其中，甲基化引物使用甲基化引物的扩增反应程序；非甲基化引物使用非甲基化引物的扩增反应程序。通过电泳检测甲基化特异性PCR的扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的甲基化引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒适于研究大量样本的DNA片段，具有方便快捷、灵敏度高、成本较低的优点。

附图说明

图1为本基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒和RT-PCR法检测健康人，肝细胞癌患者和非小细胞肺癌患者的结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1、用于检测GRP78基因启动子甲基化的甲基化特异性反应的PCR引物设计：

根据GRP78基因启动子序列如SEQ ID NO：5所示，分析其CpG岛(CpG Island)，设计出5组引物(M，甲基化引物；U，未甲基化引物)，如下表1：

表1

2、引物筛选

根据对引物GC含量(控制在45％-60％)、引物长度(控制在18-27bp，越短越好)，以及检测效果等因素的考虑和实验结果，选择第1组引物为最佳引物。并进一步进行试验研究。

实施例2

1、一种基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒，包括实施例1的用于检测GRP78基因启动子甲基化的甲基化特异性反应的PCR引物组合、甲基化特异性PCR试剂：Hotstart Taq酶，10×含Mg²⁺的PCR缓冲液，dNTP mixture，ddH₂O；修饰基因组DNA试剂：双蒸水，NaOH，NaHSO₃，石蜡油，对苯二酚(氢醌)；脱盐脱磺酸基试剂为：酚，氯仿，异丙醇，乙醇，TE缓冲液；DNA纯化试剂：蛋白酶K和RNA酶；DNA提取试剂为外周血白细胞DNA提取试剂盒。

2、利用本发明的试剂盒检测人的外周全血标本的方法，包括如下步骤：

1、模板DNA获取

(1)外周血白细胞DNA提取和纯化

外周血白细胞DNA提取和纯化采用本领域常规方法即可。

本实施例提供一种选择：使用Thermo Scientific Gene JET全血基因组DNA纯化试剂盒，具体过程如下：

(i)取200μl人的外周全血(已加入乙二胺四乙酸(EDTA)、或枸橼酸钠、或肝素抗凝血)中加入20μl蛋白酶K溶液，涡旋混匀；加入20μl RNase A溶液(10mg/ml)涡旋混匀；再加入400μl裂解液，涡旋混匀，得到均匀的悬液。

(ii)将样本置于56℃孵育10分钟，孵育期间涡旋离心管直至细胞完全裂解。

(iii)加入200μl 96-100％的乙醇，通过混合均匀。

(iv)将混合液转移入纯化柱中，6000×g离心1分钟，弃掉含废液的收集管，将纯化柱放入一个新的2ml收集管中。

(v)加入500μl的漂洗缓冲液I(已加入乙醇)。8000×g离心1分钟。弃掉废液，将纯化柱放回收集管中。

(vi)向纯化柱中加入500μl的漂洗缓冲液II(已加入乙醇)，以最大速度(≥20,000×g，≥14,000rpm)离心3分钟。弃掉含废液的收集管，将纯化柱转移入1.5ml无菌的离心管中。

(vii)向纯化柱的膜中心加入200μl洗脱缓冲液以洗脱基因组DNA。室温放置2分钟后，以8000×g(～10,000rpm)的速度离心1分钟。

(viii)弃掉纯化柱。将纯化的DNA立即用于下游实验或者贮存于-20℃。

蛋白酶K能使细胞壁破碎，核酸释放。蛋白酶K还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。RNA酶可以降解RNA，包括mRNA和小分子RNA等。因此在提取过程中使用蛋白酶K及RNA酶，以减少或避免蛋白、RNA的污染。

(2)修饰基因组DNA

将约2ug DNA于1.5ml EP管中使用ddH₂O稀释至50μl；加5μl新鲜配制的3M NaOH；42℃水浴30min；水浴期间新鲜配制10mM对苯二酚(氢醌)，加30μl至上述水浴后混合液中，溶液变成淡黄色；新鲜配置3.6M亚硫酸氢钠，1.88g亚硫酸氢钠使用ddH₂O稀释，并以3M NaOH滴定溶液至pH 5.0，最终体积为5ml。加520μl至上述水浴后溶液中。EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。加200μl石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。50℃避光水浴16h。

(3)脱盐脱磺酸基

等体积的Tris饱和酚，氯仿和DNA混合，混匀后放置五分钟，然后13000rpm离心10min；吸上层液到另一干净的EP管中，加等量的异丙醇到管中，吹吸混匀，放置10min，13000rpm离心10min，弃上清；用等体积的75％的乙醇洗沉淀一次，离心10min，将液体吸出，自然凉干沉淀，充分去掉残留的乙醇和异丙醇；加入45μl TE缓冲液，快速强力涡旋振荡直到颗粒完全悬浮；用手轻打或轻敲内容物至管顶(注意不要离心)。50℃孵育15min以洗脱DNA；高速离心3分钟并转移样本(上清)到新EP管。-20℃可保存达3个月，-80℃可保存至少1年。避免重复融化和解冻；可分量储存。

2、甲基化特异性反应的PCR

甲基化特异性PCR反应体系为：甲基化特异性PCR试剂的反应体系为：Hotstart Taq酶0.1μl，10×含Mg²⁺的PCR缓冲液2μl，dNTP mixture 1.6μl，上游引物1μl，下游引物1μl，待测样本DNA1μl，ddH₂O13.3μl，总计反应体系20μl，其中上游引物和下游引物的浓度为10nM。

甲基化特异性PCR和非甲基化特异性PCR反应程序如表2：

表2

3、琼脂糖凝胶电泳

配0.5×TBE电泳缓冲液300ml；胶浓度1.7％(40ml 0.5×TBE加0.68g胶)；微波炉中火2分钟溶解胶；冷却至60℃加入溴乙锭2μl(10mg/ml的终浓度0.5μg/ml)；放入梳子，浇板，待凝固，加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰；电泳80V(每cm 5V)，电泳1小时；凝胶成像仪观察PCR产物条带。

4、结果判断

若基因启动子发生甲基化，用甲基化特异性引物扩增可出现相应大小的条带；若未发生甲基化，用非甲基化特异性引物扩增可出现相应大小的条带。

应用例1

1、一种基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒检测健康人，肝细胞癌患者和非小细胞肺癌。按照实施例2的试剂盒和方法对5名健康人，5名肝细胞癌患者和5名非小细胞肺癌患者的样本进行检测。其中，1～5号是正常对照，6～10号是肝细胞癌，11～15号是非小细胞肺癌。

2、每个样品同时平行也进行了RT-PCR检测，具体操作步骤按照选用试剂盒的标准步骤进行，其中，人GRP78mRNA扩增引物为：

上游引物5′-CTGGGTACATTTGATCTGACTGG-3′；

下游引物5′-GTCTTCCTCAGCAAACTTCTCA-3′。扩增产物长度应为222bp。

人管家基因β-actin因为包括：

上游引物5′-CTC CATCCTGGCCTCGCTGT-3′；

上游引物5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。扩增产物长度应为268bp。

3、结果显示(图1)：正常对照组外周血GRP78的表达较低，而启动子甲基化率较高；肝细胞癌和非小细胞肺癌患者中，外周血GRP78的表达较高，而启动子甲基化率较低。说明，在肝细胞癌和非小细胞肺癌时，GRP78启动子的甲基化降低，启动子活力增加，导致GRP78的转录表达升高。因此，外周血白细胞DNA中GRP78基因启动子甲基化岛的甲基化状态，可以作为肝细胞癌和非小细胞肺癌癌变的肿瘤标记，用于这两种肿瘤的辅助诊断和发病预警提示，具有重要的临床意义。

应用例2

一种基于检测GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒检测原发性肝细胞癌患者、非小细胞肺癌患者分别与健康人的外周血白细胞DNA甲基化情况。

按照实施例1的方法对100名健康人，60名肝细胞癌患者和60名非小细胞肺癌的样本进行检测，具体临床特征见下表3：

表3：

将检测的结果进行统计，之后进行卡方(X²)检验和校正年龄和性别后的logistic回归分析，结果如下表4：

表4：

注：P₁：X²检验；P₂：，校正年龄、性别之后的Logistic回归分析。

不论是卡方(X²)检验，还是校正年龄和性别后的logistic回归分析，均有显著统计学意义(P＜0.001)，表明：在肝细胞癌和非小细胞肺癌时，GRP78启动子的甲基化降低，启动子活力增加，导致GRP78的转录表达升高。因此，外周血白细胞DNA中GRP78基因启动子甲基化岛的甲基化状态，可以作为肝细胞癌和非小细胞肺癌癌变的肿瘤标记，用于这两种肿瘤的辅助诊断和发病预警提示，具有重要的临床意义。

进一步统计和计算了使用本试剂盒进行肝细胞癌和非小细胞肺癌早期筛查的敏感性、特异性、阳性预测值和诊断符合率。结果如下表5：

表5

结果表明，检测原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌时，诊断的敏感性、特异性、阳性预测值和诊断符合率，均达到了较高的水平(均＞60％或＞70％)；而假阳性率和假阴性率均较低(30％左右)。由于原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌均具有较高的异质性。

目前并无100％特异性的免疫或基因水平的标记物。本发明使用外周血白细胞DNA中GRP78基因启动子甲基化作为癌症早期诊断的标记物，虽然不具有100％的特异性，但是可以作为有效的临床上辅助诊断的有效指标之一，可以提高肝细胞癌和非小细胞肺癌的早期诊断率并减少误诊率，对原发性肝细胞癌和非小细胞肺癌的辅助临床诊断和预警，具有重要的临床意义。

序列表

<110> 广东医科大学

<120> 一种基于检测外周血GRP78基因启动子甲基化的癌症早期筛查试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

tagttgttga attaatggga ttagc 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

cgattaataa aaaccctact cgtt 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

agttgttgaa ttaatgggat tagtg 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

caattaataa aaaccctact catt 24

<210> 5

<211> 986

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

aaggagtcat gattcgtggt cgaacagagt ccagaccagc tcgacctgtg agcaacgaac 60

ggccctgaga ctcgcatacc ccaataccgg tagtggccgt gaagggcaaa gaaatgtgtt 120

ctgaggcgat cccagcatct aagctgcgac tggtctactc agagactgga tggaagctgg 180

gaagagaaag ctgcttcccg cttcggggtg agggatggag gaagggagaa caagcagtag 240

agaagaaaaa gtttcagatc ccacagcccc ggggggtcac tcctgctgga cctactccga 300

ccccctaggg ccgggagtga aggcgggact tgtgcggtta ccagcggaaa tgcctcgggg 360

tcagaagtcg caggagagat agacagctgc tgaaccaatg ggaccagcgg atggggcgga 420

tgttatctac cattggtgaa cgttagaaac gaatagcagc caatgaatca gctggggggg 480

gcggagcagt gacgtttatt gcggaggggg ccgcttcgaa tcggcggcgg ccagcttggt 540

ggcctgggcc aatgaacggc ctccaacgag cagggccttc accaatcggc ggcctccacg 600

acggggctgg gggagggtat ataagccgag taggcgacgg tgaggtcgac gccggccaag 660

acagcacaga cagattgacc tattggggtg tttcgcgagt gtgagaggga agcgccgcgg 720

cctgtatttc tagacctgcc cttcgcctgg ttcgtggcgc cttgtgaccc cgggcccctg 780

ccgcctgcaa gtcggaaatt gcgctgtgct cctgtgctac ggcctgtggc tggactgcct 840

gctgctgccc aactggctgg caagatgaag ctctccctgg tggccgcgat gctgctgctg 900

ctcagcgcgg cgcgggccga ggaggaggac aagaaggagg acgtgggcac ggtggtcggc 960

atcgacctgg ggaccaccta ctcctg 986