本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从pcr混合产物中分离回收大小差异微小的核酸分子的方法。
背景技术：
高等生物染色体组本身较为庞大，加之进化过程中出现的染色体加倍和基因重复等现象，使得其基因组更为复杂。如人是二倍体生物，有46条染色体，基因组总量达到3gb；棉花有二倍体和四倍体之分，四倍体棉种有52条染色体，最新的陆地棉基因组测序数据显示其基因组总量达2.5gb；小麦分为一粒小麦、二粒小麦和六倍体普通小麦，普通小麦有42条染色体，基因组总量高达17gb，且80%以上是重复序列。在基因组序列克隆过程中，等位基因、同源基因和重复序列等的存在，使得某些位置很难提取到单一的目的片段，pcr获得的往往是多种dna分子的混合产物。
近年来，深度测序逐渐流行，但其价格的昂贵使得受众面偏低，且该方法属于大数据信息量获取。对于小样本量单基因测序，sanger测序法依然是最好的选择，该方法经济且高效，也是深度测序检测后进行进一步基因鉴定的主要手段。但是sanger测序存在其局限性，当pcr产物中含有两种及以上dna分子时，测序过程会出现双峰或杂峰影响测序进程，导致测序不准确或失败。因此，在利用sanger直接测序时，需要使用严格的特异性引物以获得单一的dna分子。若得到的pcr产物中仍然含有多种片段，则需要通过凝胶电泳等方法进行分离纯化最终得到单一的dna分子产物。
本实验室主要利用ssr（简单重复序列）标记从事棉花相关性状基因的定位研究。在实验过程中，我们发现一些非特异性条带有时具有重要的科研价值，因此偶尔需要利用凝胶分离回收此类片段大小具有微小差异的核酸分子进行测序。目前国内市场上，琼脂糖凝胶回收试剂盒的开发已经很成熟，大多采用核酸在高盐浓度下结合到二氧化硅基质而在低盐环境下脱离的原理。该种类试剂盒十分经济有效，在一般实验室使用的十分普遍，但琼脂糖凝胶分辨率较低，只能分离开大小差异较大的核酸分子，对于微小差异的片段则需要使用更高分辨率的page胶进行分离。目前从page胶回收核酸采取的主要方法是：1）将page胶破碎后在60度水浴溶解3小时以上；2）使用酚氯仿抽提去除杂质；3）乙醇沉淀核酸；4）加水溶解获得核酸产物，此方法过程中使用的酚氯仿属于高腐蚀性有毒物质，不够安全。也可以将page胶装入透析带进行电洗脱，但此法不仅操作麻烦且十分耗时。已有的page胶回收试剂盒同样也需要将page胶破碎后在60度水浴溶解3小时，且价格较贵（300元以上/50次）。此外，也有发明专利将含有目的核酸分子的聚丙烯酰胺胶放在琼脂糖胶孔中再次电泳，再从琼脂糖胶中回收核酸片段，该方法增加了操作上的步骤和回收的风险。
参考已有的方法，结合本实验室的实际情况和实验的需求，我们做了以下考虑：1、现有的page胶回收试剂盒回收时间过长（通常需要4小时以上），其价格较高（300元以上/50次），且只能回收小片段（500bp以下），而一般实验室使用page胶回收试剂盒的频率较低，对于较大的片段试剂盒也不是很有效，可能造成不必要的浪费；2、应尽量避免有毒有害物质的使用，减少实验步骤，使实验更加安全简便；3、由于所得到的回收产物需要进行下一步pcr实验，因此回收产物需要去除杂质，不能含有不利于下一步实验的有害物质；4、本实验室常年使用pcr产物纯化试剂盒（100元/50次），是否可以与之结合使用从而有效利用实验室现有资源获得高质量的产物。基于这几点考虑，我们创建了本发明，可以使用普通实验室已有资源快速有效分离和提取大小差异微小的核酸片段。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种从pcr混合产物中分离回收大小差异微小的核酸分子的方法的技术方案。
所述的一种从pcr混合产物中分离回收大小差异微小的核酸分子的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）经pcr获得含有目的片段的混合dna产物；
2）通过聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳将混合物中的不同dna分子分开；
3）核酸染料dnagreen染色page胶片；
4）在紫外灯下切割下含有目的片段凝胶部分，置于ep管中，用研磨棒将凝胶研磨至稀泥状；
5）以1克：1ml的比例在步骤4）的凝胶中加入te溶液，加热处理；
6）将步骤5）的混合物离心处理，保留上清液；
7）使用实验室现有的普通的pcr产物纯化试剂盒从上清液中回收获得含有目的片段的溶液；
8）将以上溶液直接作为pcr模板，扩增产物直接测序，获得目的dna分子的序列信息。
所述的一种从pcr混合产物中分离回收大小差异微小的核酸分子的方法，其特征在于所述的步骤2）中聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%-12%。
所述的一种从pcr混合产物中分离回收大小差异微小的核酸分子的方法，其特征在于所述的步骤3）中浸泡10分钟。
所述的一种从pcr混合产物中分离回收大小差异微小的核酸分子的方法，其特征在于所述的步骤5）中加热处理条件为：50℃加热30min。
所述的一种从pcr混合产物中分离回收大小差异微小的核酸分子的方法，其特征在于所述的步骤6）中离心条件为：12000rpm离心1min。
本发明中实验室现有的普通的pcr产物纯化试剂盒为axygen公司的pcr产物纯化试剂盒或“天根”pcr产物纯化试剂盒，其使用成本为100元/50次。
本发明与现有技术相比，存在以下有益效果：
1）快捷方便：摒弃传统的page胶回收3小时以上的溶解过程，本发明将溶解时间降低至30min，大大缩短操作时间，并降低溶解温度，减少核酸的降解。
2）成本低：本发明采用国内普通的pcr产物纯化试剂盒，成本是page胶回收试剂盒的1/3，且该试剂盒实际回收时间只需8分钟，可操作性强。
3）安全：全程不使用有毒物质，安全环保。
4）质量高：本发明使用国产pcr产物纯化试剂盒，利用试剂盒附带的含有二氧化硅柱的制备管，纯化核酸，提高了产物的纯度，使得原page胶中的有害物质被有效过滤，有利于后续pcr等实验进行。
5）效果好：利用pcr实验只需微量高纯度的dna模板即可实现指数级扩增的原理，本发明可回收到低浓度的高质量核酸产物，并直接作为pcr模板，pcr产物直接测序的效果良好，峰值图谱清晰，可信度高，可直接获得核酸的序列信息，完全满足实验需求。
6）资源整合利用：本发明考虑到了国内普通实验室的现状和条件，充分利用已有资源进行创新，实现各个实验间耗材试剂的整合利用，节省时间和物资成本。
附图说明
图1：ssr标记d11-1251在（y104xnld402）f2群体中的多态性银染结果；
图2：从10%聚丙烯酰胺凝胶中切割的目的条带，红框表示目的片段；
图3：目的片段在1%琼脂糖凝胶电泳结果，a)为pcr产物纯化试剂盒回收后的产物;b)纯化产物直接pcr的产物；
图4：pcr产物直接测序结果的峰值图；
图5：位于棉花染色体d03上d11-1251序列在y104和nld402之间的差异；
图6：nld402早熟基因相关qtl遗传连锁图谱。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例
简单重复序列（simplesequencerepeats，ssr），也称为微卫星dna，它是一类由几个核苷酸（1-6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。每个ssr两侧的序列相对保守，但是重复单位的数目存在高度变异，而导致不同品种间在同一位点呈现多态性。基于此原理，ssr被发展为一种以特异性引物pcr为基础的分子标记技术，经ssr引物扩增获得的产物在不同个体间的同一位点上呈现的多态性称为简单序列重复长度多态性(simplesequencelengthpolymorphism，sslp)。基于sslp，找到与性状高度连锁的ssr标记，便可以确定基因的位置，这是寻找性状基因的有效手段。
本实验室长期使用ssr标记进行棉花相关性状基因或qtl(数量性状基因座)的定位。使用棉花晚熟品种y104和早熟品种nld402作为亲本，获得重组自交系f2群体。在用该群体定位棉花早熟基因的过程中，我们发现ssr标记d11-1251(f:5′tgtcctaatttggcaggggg3′;r:5′tgctattcactccttacttgca3′)在亲本间具有多态性，但是该多态性不是来源于主要的扩增dna条带（主带），而是来源于一条扩增效率更低的非特异性扩增片段（副带），见图1。该副带多态性在群体中稳定存在，且与性状高度连锁，这就说明实际的性状基因位于副带所在染色体上。为确定该性状基因的实际位置，我们对该副带进行回收测序。具体实验过程和步骤如下:
1）分别使用y104和nld402的dna做模板，经pcr获得含有目的片段的混合物（大小约210bp），该混合物在2%琼脂糖凝胶电泳中只显示为一个条带；
2）配置10%聚丙烯酰胺凝胶，通过垂直电泳（220v，1hr）将混合物中的不同dna片段分开；
3）核酸染料dnagreen浸泡page胶片，染色10分钟；
4）在紫外灯下切割下含有目的片段凝胶部分（见图2），置于2ml的ep管中，用研磨棒将凝胶研磨至稀泥状；
5）以1（克）：1（ml）的比例加入te溶液，于50℃加热30min；
6）上述混合物置于离心机，于12000rpm离心1min，保留上清液；
7）使用实验室现有的普通pcr产物纯化试剂盒（axygen或天根）（100元/50次）从上清液中回收获得高纯度的dna片段的溶液30ul；
8）取5ul上述回收液，于1%琼脂糖凝胶电泳检查结果，发现两种回收后产物浓度均非常低，y104产物和nld402产物基本肉眼观察不到（见图3a）；
9）由于是高纯度，低浓度，故无需稀释即可直接作为模板，使用d11-1251引物经pcr扩增后获得清晰的dna条带（见图3b），将本次pcr产物直接正反向测序，测序效果良好，峰值图谱清晰，可信度高（见图4）。将双向测序结果整合分析后，发现该副带为染色体d03上的某一位置，这一位置在y104和nld402之间在第46bp处存在4个碱基的差异（见图5）。
之后，我们在d03上d11-1251位置的前后开发了其他ssr标记，验证了以上实验的正确性。该位置附近的标记d3-018（f:5′taaggtcttattggacggtttggt3′r:5′atttgtttgcatcctcctcctagt3′）、d3-133（5′ccttcaccatctacgacgagtatt3′r:5′atttctcctcctataagacacttgt3′）和d03-1489（5′cctgcaacccagaagcacta3′r:5′tcaccacctactacactaacaaact3′）也同样出现与性状高度连锁的情况。利用qtlicimapping软件对f2群体进行遗传连锁分析，我们构建了棉花染色体d03的遗传图谱，d3-018至d03-1489大约相差7.49cm，在该区间检测到一个lod约为4.5的峰值，表明在此区段存在一个与早熟性状相关的qtl（图6）。通过本实验，加速了我们科研的进程，提早将nld402早熟基因锁定在d03染色体上。本实验由于结合利用了实验室现有的pcr产物纯化试剂盒，使得回收到的核酸产物纯度高，并有效过滤了page胶所携带的有害物质，防止对下一步实验造成影响；又由于page胶溶解时间较短，使得dna分子的获得率低，可直接作为pcr的模板获得高浓度dna拷贝，并取得了可靠测序结果。本方法经济有效，完全满足本类实验的需求，且无需另购试剂耗材，充分利用已有资源进行创新，实现各个实验间耗材试剂的整合利用。