本发明涉及蛋白质纯化，具体地说，涉及一种目的蛋白的纯化方法。
背景技术：
：生物制药技术日新月异，为人类健康事业发挥了巨大作用，大规模，经济的纯化技术是其中关键的环节，直接决定了产品质量。生物制药蛋白质药物与疫苗一般利用真核或原核细胞系表达，该细胞系被工程化为含有编码目的蛋白基因的重组质粒表达目的蛋白。由培养基和副产品的混合物中分离纯化出所需目的蛋白到足够的纯度，又要保证回收率以保持一定生产能力，对于生物制品纯化人员来说，无疑是巨大的挑战。由于蛋白质的药物生产必须符合药典规定，包括严格的纯度要求，所含杂质很低，因此，对于细菌表达的重组蛋白制品，前处理通常包括较多步骤，如离心，超滤，硫酸铵沉淀等，去除细菌碎片和初步纯化以减轻后续纯化压力。一般来说，在使用层析柱进行层析处理前，样品需要经过过滤膜死端过滤，通常为0.22微米孔径或0.45微米孔径，以保证样品对于层析柱内的层析填料不会造成堵塞，对于大多数样品，离心，超滤，过滤膜等步骤都是必须和适当的，这几个步骤成为了细菌表达的重组蛋白制品通常的前处理方法。但是，由于不同蛋白性质不同，有些蛋白会堵塞超滤膜孔，造成超滤和过滤困难，尽管有例如批次吸附技术等解决这一问题，但由于需要特殊设备，若能在层析柱上实现不需要超滤和过滤即可上柱，将大大简化纯化流程以及减少产物损失，以达到回收率和产率要求。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种目的蛋白的纯化方法。为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：本发明提供了一种从包含目的蛋白和至少一种污染物的混合物中纯化目的蛋白的方法，将所述混合物先后进行阴离子交换层析步骤和阳离子交换层析步骤，即可实现目的蛋白的分离纯化。进一步地，所述混合物为宿主细胞表达的含目的蛋白的发酵产物，例如，可以是细菌表达的重组胞内蛋白发酵液。所述宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞或动物细胞等。优选大肠杆菌。进一步地，所述目的蛋白为宿主细胞表达的胞内蛋白，优选为可广泛被基因工程化来表达的的蛋白，尤其是胞内蛋白。例如，前文所述的细菌表达的重组胞内蛋白发酵液，可为将目的蛋白的dna导入宿主细胞后，经宿主细胞发酵所得的含有重组胞内蛋白的发酵液。进一步地，所述污染物选宿主细胞胞内蛋白、宿主细胞代谢物、宿主细胞组成蛋白质、核酸、内毒素、产物相关的污染物、脂质、培养基添加物或培养基衍生物中的一种或多种。进一步地，所述阴离子交换层析在ph为为4～10，且电导率为0.1～10ms/cm的条件下进行，优选ph值为7～9且电导率为0.5～5ms/cm。进一步地，所述阴离子交换层析在ph值为3～10，且电导率为0.1～40ms/cm的条件下进行，优选ph值为4～9且电导率为0.5～15ms/cm。进一步地，所述阴离子交换层析柱的填料粒径不小于75μm。可选的，所述阴离子交换层析柱为qsepharosebigbeads，qsepharosexl，toyopearlgigacapq-650m，toyopearlgigacapdeae-650m或unosphereq，它们的填料粒径分别为200μm，90μm，75μm，75μm，120μm，大孔径的设计，使它们可以承受粗制发酵液上样造成的粘度，从而实现较低的反压，因而对于仅经过离心去除细菌碎片处理，而不进行超滤和过滤处理的样品处理成为可行。此外，这几款填料还具有高结合载量，具有较高线性流速，可满足重复的在位清洗，具有良好的化学稳定性的特点，这些共同的特点能够实现可靠的高产率和批间稳定性，对于生物医药生产来说，是必不可少的。可选的，所述阳离子交换层析柱的填料选自以下填料之一：日本东曹生物科技有限公司的toyopearlgigacaps-650m，toyopearlsp-650s，m，c，toyopearlsp-550c，toyopearlcm-650s，m，c，toyopearlmegacapiisp-550ec，美国伯乐公司的25sresin，highsresin，cmresin，unospheretmsmedia，source15s，source30s，美国ge公司的spsepharosehp，spsepharoseff，ssepharoseff，cmsepharoseff，captos，captosimpact。经过阳离子交换层析后，目标蛋白被进一步纯化，已达到内毒素小于30eu/mg和目标蛋白纯度大于95％的要求。作为优选，在混合物进行阴离子交换层析之前，对混合物进行匀浆破碎，但无需进行切向流过滤和/或滤器死端过滤等过滤或超滤步骤。所述匀浆破碎聚体可为按照1:15-1:5的比例，向所述混合物中加入破碎液，低温匀浆破碎400bar-800bar。破碎后4000-6000g离心10-20分钟，弃沉淀，取上清液。本发明还提供了一种制备目的蛋白的方法，培养可表达目的蛋白的宿主细胞，将所述宿主细胞和/或其产物利用本发明所述纯化方法，分离纯化目的蛋白。本发明还提供了所述纯化方法在制备基因工程化表达重组胞内蛋白质中的应用。作为优选，所述重组胞内蛋白质用于制备疫苗。在本发明的具体实施例中，以示例性说明记载了本发明所述方法对大肠杆菌发酵液中目的蛋白的纯化过程。大肠杆菌表达系统是生物制药中十分常见且成熟的表达系统，其优势为繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定、成本低廉。但其也存在部分劣势，如细胞周质内含有种类繁多的内毒素，为目的蛋白的纯化带来较大难度。由于不同的蛋白质表达方法不同，一些蛋白质直接由细胞分泌到周围的培养基中，另外的蛋白质则被保留在细胞内。对于后者，产生于细胞内的蛋白质，需要利用比如高压均质破碎，酶处理等方法使其细胞裂解，因此，细胞内其他杂质也同时被释放到匀浆中。对于前者，由于细胞的自然死亡和宿主细胞内蛋白质的释放，分泌的蛋白质也会产生前述问题，虽然程度比前者要小得多。因此，对于大肠杆菌表达重组胞内蛋白质，常规技术的前处理方法是经过高压均质等方法破碎后，先离心去除细胞碎片或裂解片段等杂质，然后通过超滤和死端过滤进行进一步前处理，以满足上层析填料的要求。本发明所述方法，格外适宜对保留在细胞内的目的蛋白的分离纯化，可有效减少纯化产物中细胞内其他杂质的残留。根据本发明所述纯化方法，一旦获得含有目的蛋白的混合物，即通过大肠杆菌胞内表达的重组蛋白质，即可如上文所述，破碎细菌细胞后，经过离心，获得上清液，在适当条件下利用粒径较大的阴离子交换层析填料与接下来的阳离子填料纯化，即可实现混合物中污染物的分离。本发明方法的前处理不需要tff与死端过滤，仅需要将大肠杆菌破碎后离心，既满足层析步骤对于杂质处理的要求。本发明的层析步骤可以在柱上进行。尽管前处理没有经过tff与死端过滤，在层析柱中仍可以满足压力低于承受值，一般为0.3mpa，且在层析柱内的上样、清洗、洗脱、再生流速不受影响。如有必要，依照本发明所述方法纯化得到的目的蛋白可进行额外的再处理(包括再纯化)步骤。本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种从包含目的蛋白和至少一种污染物的混合物中纯化目的蛋白的方法，所述混合物尤其是含目的蛋白的发酵产物，特别是细菌表达的重组胞内蛋白发酵液，在对混合物进行匀浆破碎后，无需使用切向流过滤和滤器死端过滤，仅先后进行阴离子交换层析步骤和阳离子交换层析步骤，即可实现目的蛋白的分离纯化。所获得的目的蛋白纯度可达95％以上，且内毒素小于30eu/mg。本发明不仅对于某些不适于超滤和过滤的蛋白有重要价值，对于其他蛋白质也节约了处理时间，提高了目的蛋白的回收率。按照本发明所述方法纯化得到的目的蛋白或含有目的蛋白和药学可接受载体的组合物，可用于对此类目的蛋白和组合物已知的各种诊断、治疗或其他用途，例如人类疫苗制品的制备等。本发明所涉及的术语或名词解释如下：本发明所述的“蛋白质”通常指由多肽键连接在一起的氨基酸的肽和蛋白质。蛋白质一般是复杂多肽。按照本发明的方法纯化的蛋白质可以来自任何生物(原核生物或真核生物)，特别是大肠杆菌。蛋白质是由α-氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成的高分子化合物。由多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质，这类大分子化合物数量庞杂、特性各异。本发明所述的“混合物”包含目的蛋白和至少一种污染物，即杂质。混合物来源于生产该蛋白质的宿主细胞或生物体，且仅经过离心这一种纯化手段进行前处理。该混合物在离心前需要进行制备以满足进行下一步阴离子交换层析柱的条件，所述制备包括将该混合物进行浓缩缓冲液加入以调节ph值，离心后需要进行稀释以满足电导率条件。术语“杂质”和“污染物”以及其语法上的变化可互换地用于表示除了期望从含有目的蛋白的组合物中移出的目的蛋白以外的任何物质。污染物包括但不限于任何生物大分子例如宿主蛋白质，目的蛋白之外的蛋白质、核酸(如dna和rna)、脂类、糖类、内毒素、细菌或其他微生物例如酵母、培养基成分，和作为在层析中使用的填料的部分以及可能在层析过程中进入样品的任何分子，等等。术语“目的蛋白”指期望根据本发明的方法从混合物中纯化获得的蛋白质。术语“纯化”以及其语法上的变化用于表示完全或部分地去除包含蛋白质和一种或多种杂质的混合物中的至少一种杂质，降低该组合物中杂质的含量，从而提高组合物中蛋白质的纯化水平。术语“层析”是指通过在该方法的特定缓冲液条件下使该混合物流经层析填料，从而将目的溶质即目的蛋白与其他溶质分离的方法，分离原理是由于溶质的各种性质例如等电点，大小，结构等不同，与填料的结合强弱不同，因此保留时间不同，从而从层析填料上洗脱时间不同。术语“填料”是指能够与目的蛋白或杂质直接相互作用将其吸附到其表面上的固定的固态物质。各种类型的层析填料在本领域是公知的并且通过商业途径可以容易地获得。术语“离子交换”和“离子交换层析”指一种层析方法，其中目的可离子化溶质在适当的ph值和电导率条件下与填料上带相反电荷的配体互相作用，以致目的溶质与混合物中其他溶质与填料的作用强弱不同。混合物中的污染物可以比目的溶质更快或更慢地从离子交换层析填料上洗脱。“离子交换层析”具体包括阴离子交换层析，阳离子交换层析以及混合模式层析。“阴离子交换层析”指代有正电荷因而其上附有一种或多种带正电的配体的固相。“阳离子交换层析”指代有负电荷因而其上附有一种或多种带正电的配体的固相。本发明中使用的“缓冲液”是通过其酸-碱共轭成分的作用阻止由酸碱引起的ph值变化的溶液。多种缓冲液可用于本发明的方法中，取决于所需缓冲液的ph值以及纯化的步骤。可用于控制本发明方法所需ph值范围的缓冲液成分包括但不局限于tris、hepes、mops、mes、琥珀酸盐，柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐等。缓冲液的ph值和电导率可根据纯化方法不同步骤而改变。在阴离子交换层析中，ph值为4～10且电导率为0.1～10ms/cm，优选ph值为7～9且电导率为0.5～5ms/cm。在阳离子交换层析中，ph值为3～10且电导率为0.1～40ms/cm。优选ph值为4～9且电导率为0.5～15ms/cm。“平衡缓冲液”指用于向层析填料中装载含有待纯化目的蛋白混合物之前先将层析填料的ph值和电导率进行调节的缓冲液。在阴离子交换层析中，平衡缓冲液ph值为4～10且电导率为0.1～10ms/cm，优选ph值为7～9且电导率为0.5～5ms/cm。在阳离子交换层析中，平衡缓冲液ph值为3～10且电导率为0.1～40ms/cm。优选ph值为4～9且电导率为0.5～15ms/cm。“上样缓冲液”用于将目的蛋白的混合物上样到层析柱上。一般来说，上样缓冲液与平衡缓冲液一致。在阴离子交换层析中，上样缓冲液ph值为4～10且电导率为0.1～10ms/cm，优选ph值为7～9且电导率为0.5～5ms/cm。在阳离子交换层析中，上样缓冲液ph值为3～10且电导率为0.1～40ms/cm。优选ph值为4～9且电导率为0.5～15ms/cm。“清洗缓冲液”是指在洗脱目的蛋白之前，从层析填料上将杂质除去的缓冲液。其ph值和电导率至少有1项与平衡缓冲液不同，且使杂质从层析柱上洗脱下来而目的蛋白保留在层析填料上。在阴离子交换层析中，清洗缓冲液ph值为4～10且电导率为0.1～180ms/cm，优选ph值为7～9且电导率为0.5～45ms/cm。在阳离子交换层析中，清洗缓冲液ph值为3～10且电导率为0.1～180ms/cm。优选ph值为4～9且电导率为0.5～45ms/cm。“洗脱缓冲液”指从层析填料上将目的蛋白洗脱所需要的缓冲液。所述适当的条件例如通过改变缓冲液的离子强度或ph值，从而改变目的蛋白与层析填料的结合能力，将其洗脱下来。“洗出液”指对层析填料进行洗脱时从柱上洗下的含有目的蛋白的流出液。在阴离子交换层析中，洗脱缓冲液ph值为4～10且电导率为0.1～180ms/cm，优选ph值为7～9且电导率为45-90ms/cm。在阳离子交换层析中，洗脱缓冲液ph值为3～10且电导率为0.1～180ms/cm。优选ph值为4～9且电导率为45-90ms/cm。在洗脱后，层析填料可以根据需要进行净化、再生。一般来说，净化和再生溶液具有能够从层析填料上将其他任何残留的杂质去除的能力。“电导率”是用来描述物质中电荷流动难易程度的参数，标准单位是西门子/米(简写做s/m)。随着离子量的增加，溶液将具有更高的电导率。电导率与温度具有很大相关性，在一段温度值域内，电导率可以被近似为与温度成正比，在本发明的一般方法中，纯化一般可以在4～37℃进行，优选15～25℃。电导率值可用电导仪进行测量。“切向流过滤”或“tff”是一种过滤方法，指液体流动方向与过滤方向呈垂直方向的过滤形式，液体流动在过滤介质表面产生剪切力，减小了滤饼层或凝胶层的堆积，保证了稳定的过滤速度。与传统的死端过滤比，其处理料液的体积大大增大。因此且切向流过滤方式被广泛地应用于生物制药处理过程。然而，在本发明中，前处理中的tff是不必要的，因为可以直接将离心后发酵液上样至层析填料中。“死端过滤”，又叫全量过滤。是将原水置于膜的上游，在压力差的推动下，水和小于膜孔的颗粒透过膜，大于膜孔的颗粒则被膜截留。但是，随着时间的增加，膜面上堆积的颗粒也在增加，通常堆积在膜面上，过滤阻力增大，膜渗透速率下降，下降到一定程度时，必须更换膜。在本发明中，前处理中死端过滤是不必要的，因为可以直接将离心后发酵液上样至层析填料中。附图说明图1为本发明利用离子交换层析纯化目的蛋白的方法流程图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1本实施例用于说明利用本发明所述的纯化目的蛋白的方法，对大肠杆菌表达的胞内重组蛋白进行纯化。具体如图1所示，主要包括离心步骤，以及经离心处理的粗发酵液依次经过大粒径阴离子填料和阳离子填料而进行的阴离子交换层析步骤和阳离子交换层析步骤。在阴离子交换层析步骤和阳离子交换层析步骤之间可采用稀释步骤，以减少超滤方法所造成的损失。可通过加入水以及缓冲液母液及少量酸碱以达到此目的。本实施例纯化的目的蛋白为大肠杆菌表达的重组nada蛋白质，纯化的对象为大肠杆菌发酵液。进一步地，纯化方法具体包括如下步骤：(1)将大肠杆菌发酵液以4000g离心10分钟，弃上清，留菌体。称量50克此菌体，按照1:10加入破碎液20mmol/ltris-hcl(ph值8.0)，600bar低温匀浆破碎。破碎后4000g离心15分钟，弃沉淀，取上清液。(2)利用微量酸/碱、水及1mol/ltris-hcl(ph值8.0)，调节所述上清液的ph值和电导率与平衡缓冲液20mmol/ltris-hcl(ph值8.0)一致。(3)平衡阴离子交换层析柱，填料为toyopearlgigacapdeae-650m(粒径为75μm)。上样完毕，平衡3cv，进行阶段洗脱，以20mmol/ltris-hcl，250mmol/lnacl，ph值8.0清洗杂蛋白，20mmol/ltris-hcl，500mmol/lnacl，ph值8.0洗脱目的蛋白，收集目的蛋白洗脱液。(4)利用水、1mol/lph5.0柠檬酸-磷酸氢二钠母液、以及少量酸/碱，调节步骤(4)所得目的蛋白洗脱液的ph值和电导率与阳离子交换层析平衡缓冲液20mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠(ph值5.0)一致。(5)平衡阳离子交换层析柱，填料为spseph值aroseff。上样完毕，平衡3cv，进行阶段洗脱，以20mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠，90mmol/lnacl，ph值5.0缓冲液清洗杂蛋白，以20mmol/l柠檬酸-磷酸氢二钠，250mmol/lnacl，ph5.0缓冲液洗脱目的蛋白，收集目的蛋白，即可。利用lowry法测阳离子交换层析洗脱目的蛋白含量以计算回收率，利用鲎试剂法测定内毒素，利用hplc-sec检测蛋白质纯度，结果如表1所示。表1检测方法参数结果lowry法nada蛋白质总回收率79％鲎试剂内毒素小于25eu/mghplc-secnada蛋白质纯度大于95％其中，上述大肠杆菌发酵液获得方法如下：制备大肠杆菌表达的重组b群脑膜炎蛋白中的nada蛋白。将目的dna与pet-24b载体连接为表达质粒，转化dh5α菌株，转入大肠杆菌bl21(de3)表达宿主细胞，接种到ph值7.0的lb培养基，培养表达重组蛋白。37度培养，ph值控制在7.0左右，至对数期与平台期前开始加入终浓度为1mmiptg进行诱导。6h停止发酵，收集发酵液。本实施例以大肠杆菌表达的重组nada蛋白质作为目的蛋白，验证了本发明所述纯化方法对于本领域公知的最难分离纯化的胞内蛋白的纯化效果。对于其他更易被分离和纯化的目的蛋白(例如胞外蛋白等)来说，采用本发明所述纯化方法可同样实现良好的分离纯化。本发明经实验研究验证，当采用本实施例所述方法对表达其他重组蛋白的大肠杆菌及其他细胞(如cho细胞)进行目标蛋白的纯化时，其纯化效果与实施例1相似。对比例1本对比例与实施例1的区别在于：离心步骤，以及经离心处理的粗发酵液依次经过非大粒径即小粒径阴离子填料步骤，具体粒径为35μm。具体为：(1)将大肠杆菌发酵液以4000g离心10分钟，弃上清，留菌体。称量50克此菌体，按照1:10加入破碎液20mmol/ltris-hcl(ph值8.0)，600bar低温匀浆破碎。破碎后4000g离心15分钟，弃沉淀，取上清液。(2)利用微量酸/碱、水及1mol/ltris-hcl(ph值8.0)，调节所述上清液的ph值和电导率与平衡缓冲液20mmol/ltris-hcl(ph值8.0)一致。(3)平衡阴离子交换层析柱，填料为toyopearldeae-650s。上样至约1/5总体积，压力超过0.3mpa，且压力还在随上样量增加持续升高，为保证填料不破碎，终止上样。实验发现，当不采用大孔径阴离子填料，且不经常规操作中的超滤与死端过滤处理的粗发酵液会造成层析柱堵塞，压力升高，无法进行正常纯化步骤。由此可见，本发明通过采用粒径大于75μm的填料进行阴离子交换层析，可不再需要常规操作中的超滤与死端过滤处理，即可实现目的蛋白的纯化。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12