一种检测绵羊胴体肌肉性状的试剂盒的制作方法

本实用新型涉及一种检测绵羊胴体肌肉性状的试剂盒。

背景技术：

脂肪组织在机体能量储存、糖类代谢和脂肪酸代谢中扮演十分重要的角色。脂联素（Adiponectin，ADIPOQ）是一种脂肪细胞家族因子中的脂肪因子，其主要在白色脂肪组织表达，但在其它组织中也能检测到该脂肪因子，如：棕色脂肪组织、骨髓、肝脏和骨骼肌。脂联素主要通过与脂联素受体（ADIPOR）协同调节其特殊的生理功能，对动物机体的脂肪酸氧化、糖类摄取及胰岛素的分泌调节具有重要的作用。

ADIPOQ基因首先在人类3号染色体中发现，全长与17kbp，包含3个外显子和2个内含子，其中，第1外显子，部分第2外显子和第5外显子不参与编码氨基酸，属于UTR区，ADIPOQ基因CDs区共编码247个氨基酸。

ADIPOQ基因遗传变异具有独特的生物学功能。研究表明，ADIPOQ基因遗传变异与猪背脂肪厚度、背最长肌脂肪酸链长度，胴体性状及肉质等性状相关；与牛的背膘厚、眼肌面积、大理石花纹和肉质等级具有一定关联性。

目前，ADIPOQ基因作为一种与脂肪生长相关的候选基因在国内外广泛研究，并在动物分子遗传育种标记方面加以应用。绵羊胴体肌肉性状相关基因分子标记选种技术基于PCR-SSCP技术对待测绵羊的ADIPOQ基因启动子区进行多态性分析，然后根据检测结果判定携带不同等位基因的胴体肌肉性状的优良，从而有效提高绵羊胴体肌肉性能的评估，加快绵羊的改良进程、提高绵羊的个体经济效益。

上述检测过程需要使用多种试剂，因此很需要有一种试剂盒，能够将试剂瓶及主要辅助检测用品集装在一个盒中作为一个单元取用，检测者使用时只需取一次盒即可实施操作，使用完可以存回原盒送检，这将是很方便之举，同时这样也可避免造成二次污染。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种检测绵羊胴体肌肉性状的试剂盒，该试剂盒用于绵羊胴体肌肉性状相关基因分子选种技术，将检测过程中所使用的多种试剂存放在一起，使用方便，能够避免造成二次污染。

本实用新型提供一种检测绵羊胴体肌肉性状的试剂盒，包括盒盖、盒体和置于盒体内部的衬垫，在所述衬垫上平行且对称设有用于放置冰块的凹槽一和凹槽二，将衬垫分为3排，在衬垫的第一排设有容器孔一和长方型凹槽，第二排横向设有大小一致且均匀排布的四个容器孔，分别为容器孔二、容器孔三、容器孔四和容器孔五，第三排一侧设有两列大小一致、平行且均匀排布的容器孔，每列有两个容器孔，分别为容器孔六、容器孔七、容器孔八和容器孔九，在第三排另一侧设有容器孔十，十个容器孔均为圆柱形，其直径大小为：容器孔十＞容器孔一＞容器孔六＞容器孔二。

作为优选，所述盒盖和盒体为活动连接或扣合。

作为优选，所述第二排的宽度小于另外两排的宽度。

作为优选，所述衬垫的厚度在5厘米以上。

作为优选，所述衬垫的厚度小于10厘米。

作为优选，所述凹槽一和凹槽二的深度一致，均在衬垫厚度的1/2-2/3之间。

作为优选，所述容器孔一与长方形凹槽的间距大于2.5厘米。

作为优选，所述容器孔六至十的相邻边缘的间距均大于2.5厘米。

作为优选，所述十个容器孔的深度均大于衬垫厚度的1/2并小于衬垫厚度的2/3。

本实用新型的试剂盒将检测过程中所使用的多种试剂存放在一起，使用方便，能够避免造成二次污染，设计合理，取用方便。

附图说明

附图用来提供对本实用新型的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本实用新型的实施例一起用于解释本实用新型，并不构成对本实用新型的限制。在附图中：

图1为4种标准等位基因DNA样本SSCP带型；

图2为本实用新型的检测绵羊胴体肌肉性状的试剂盒；

在图2中：盒盖：1，盒体：2，衬垫：3，凹槽一：4，凹槽二：5，容器孔一：6，长方形凹槽：7，容器孔二：8，容器孔三：9，容器孔四：10，容器孔五：11，容器孔六：12，容器孔七：13，容器孔八：14，容器孔九：15，容器孔十：16。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本实用新型，但并不限定本实用新型。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1、试验材料

本实用新型绵羊样品459份，均采自新西兰罗姆尼羊群体，收集具有胴体肌肉性状指标（热胴体重、后腿瘦肉量、腰部瘦肉量、肩部瘦肉量、总瘦肉量、后腿瘦肉比例和肩部瘦肉比例）的DNA血样，采用NaOH两步法提取绵羊基因组DNA。

2、引物设计和PCR扩增

根据GenBank公布的ADIPOQ基因参考序列（登录号NC_—019458.1），应用Primer 5.0在线设计特异性引物，对绵羊ADIPOQ基因启动子区进行扩增。引物序列为：

ADIPOQ-F：5’-TTCCTGCTTCTGATCTTGACC-3’；

ADIPOQ-R：5’-CAGCCTAGAAATTGAATCAGTC-3’。

PCR反应体系为：

总体积20 μL，10×buffer缓冲液2μL，5×Q溶液2μL，3 μM MgCl₂ 1.2μL，150 μM dNTPs1.2μL，0.25 μM上下游混合引物1μL，0.5 U Taq聚合酶0.1μL，一个用于承载待测样本DNA或阳性对照的1.2mm滤纸小圆盘和12.5μL的ddH₂O。

PCR扩增条件：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃退火30 s，72℃延伸30秒，共37个循环，最后延伸5分钟，得到约372bp大小的PCR产物。

3、PCR产物的SSCP检测

为保证检测样本等位基因结果的准确性，将等位基因标准DNA样本与待测样本同时进行SSCP电泳，参照标准等位基因DNA样本（ADIPOQ*A、ADIPOQ*B、ADIPOQ*C和ADIPOQ*D）判定待测样本等位基因类型，4种标准等位基因DNA样本SSCP带型如图1所示。4种标准等位基因的核苷酸序列分别为：

ADIPOQ*A的标准DNA样的核苷酸序列为：

ADIPOQ*B的标准DNA样的核苷酸序列为：

对绵羊胴体肌肉生产性能无影响的ADIPOQ*C核苷酸序列为：

对绵羊胴体肌肉生产性能无影响的ADIPOQ*D核苷酸序列为：

其中，等位基因见表1。

表1 罗姆尼羊ADIPOQ等位基因碱基突变

SSCP电泳方法为：

在20μL的PCR工作产物中加入100μLSSCP上样变性缓冲液（98%去离子甲酰胺、10mM EDTA、0.025%溴酚蓝和0.025%二甲苯青）。105℃热变性5分钟后立即置于冰水混合物中，然后将10μL变性产物上样于16 × 18 cm的14%非变性聚丙烯酰胺凝胶（Arc：Bis=37.5:1）中，在300V电压，0.5倍TBE，17 ℃电泳槽中电泳19h。银染显色后判型、拍照并干燥保存。

4、克隆、测序判定等位基因序列

根据SSCP检测结果，选取不同基因型的个体利用纯化试剂盒纯化后测序；对所检测到的等位基因只存在于杂合子中的PCR产物，进行克隆纯化后送华大生物公司进行测序。测定结果通过MegAlign软件与等位基因标准DNA核苷酸序列（ADIPOQ*A、ADIPOQ*B、ADIPOQ*C和ADIPOQ*D）进行比对。

5、数据分析

应用MINTAB（Version 16）一般线性混合效应模型（General Liner Mixed-effect Models，GLMMs）评估特定等位基因的存在/缺失胴体肉质性状存在影响。

对某一特定基因性状进行存在（1）缺失（0）分析模型中，等位基因、家系影响、性别、出生等级为固定因素，遵从下列模型进行最小二乘方差分析：

Y_ijknm = μ+G_i+C_j+M_k+F_m+X_n+e_ijknm

其中，Y为相应性状，μ为群体均值，G_i为家系效应，C_j为性别效应，M_k为出生等级效应，F_m等位基因效应，X_n为因素间互作效应，e_ijknm为随机误差。

6、罗姆尼羊ADIPOQ基因启动子区各等位基因与胴体肌肉性状相关性分析

在ADIPOQ基因启动子区上鉴定出4条等位基因链（A、B、C和D），但是等位基因C和D在新西兰罗姆尼羊中的被检出率很小，频率小于5%，建议淘汰。因此，只对等位基因A和B对绵羊胴体肌肉性状进行了分析。

结果表明，对屠宰的459个绵羊样本进行变异与胴体性状分析表明，等位基因A与热胴体重、后腿瘦肉量、腰部瘦肉量和总瘦肉量均有一定的相关性（P值分别为：0.036、0.001、0.006和0.001；见表2）；等位基因B与后腿瘦肉量、后腿瘦肉比例和肩部瘦肉比有一定相关性（P值分别为：0.039、0.017和0.020；见表2）；多因素矫正以上结果亦均有显著相关性（P < 0.05）。其它胴体肌肉性状与这2个等位基因均没有显著相关性。

等位基因存在与缺失结果表明，存在等位基因A的群体具有较低的热胴体重、后腿瘦肉量、腰部瘦肉量和总瘦肉量；存在等位基因B的群体具有较高的后腿瘦肉量、后腿瘦肉比例和较低的肩部瘦肉比例（见表2）。

根据上述分析鉴定结果，实际生产中若需要较高的热胴体重、后腿瘦肉量、腰部瘦肉量和总瘦肉量生产性能，建议淘汰含有等位基因A的个体；同时存在等位基因B的个体具有较高的后腿瘦肉量、后腿瘦肉比例和较低的肩部瘦肉比例，所以，等位基因B同样可参考作为绵羊胴体肌肉性能的基因标记。因此认为淘汰只携带等位基因A的个体可改善绵羊后代群体的胴体肌肉生产性能。

表2 ADIPOQ基因启动子变异体对罗姆尼绵羊胴体肌肉性状的影响

注：粗体表示相关性显著（P < 0.05），斜体表示有影响趋势（0.05 < P < 0.2）；

实施例2

如图2所示，本实用新型的与绵羊胴体肌肉性状相关的PCR-SSCR试剂盒包括盒盖1、盒体2和置于盒体内部的衬垫3，盒盖1和盒体2可以是活动连接，也可以是扣合。在衬垫3上平行且对称设有用于放置冰块的凹槽一4和凹槽二5，将衬垫分为3排，其中，第二排的宽度小于另外两排的宽度，以确保两个凹槽间放置的阳性对照样品能够保持低温。

衬垫3的厚度在5厘米以上，确保为各个试剂提供足够的缓冲力，优选厚度为小于10厘米，以免浪费材料。衬垫的材质为海绵或泡沫。

凹槽一4和凹槽二5的深度一致，均在衬垫厚度的1/2-2/3之间。该深度的设置，使得在其中放入冰块时，能够更好的降低各个试剂的温度，且在运输时，凹槽底部的衬垫具有足够的缓冲作用，确保冰块不会穿透衬垫而到达试剂盒内侧底部。

在衬垫3的第一排设有容器孔一6和长方型凹槽7，容器孔一6与长方形凹槽7的间距大于2.5厘米，以提供足够的缓冲力，为了节省材料，优选间距小于5厘米。

第二排横向设有大小一致且均匀排布的四个容器孔，分别为容器孔二8、容器孔三9、容器孔四10和容器孔五11，四个容器孔相邻边缘的间距大于2厘米，为了节省材料，优选间距小于5厘米。

第三排一侧设有两列大小一致、平行且均匀排布的容器孔，每列有两个容器孔，分别为容器孔六12、容器孔七13、容器孔八14和容器孔九15，在第三排另一侧设有容器孔十16，容器孔六至十的相邻边缘的间距均大于2.5厘米，为了节省材料，优选间距小于5厘米。

十个容器孔均为圆柱形，其直径大小为：容器孔十＞容器孔一＞容器孔六＞容器孔二，这样能够很方便的区分各类试剂；十个容器孔的深度均大于衬垫厚度的1/2并小于衬垫厚度的2/3，这样运输时能产生足够的缓冲力，优选为十个容器孔的深度相同。

在容器孔一中放置装有PCR反应液的试剂瓶，在容器孔二到容器孔五中依次放置装有标准等位基因DNA样本：ADIPOQ*A、ADIPOQ*B、ADIPOQ*C和ADIPOQ*D的试剂瓶，在容器孔六中放置装有TEMED溶液的试剂瓶，在容器孔七中放置装有10%过硫酸铵溶液的试剂瓶，在容器孔八中放置装有SSCP上样变性缓冲液的试剂瓶，在容器孔九中放置装有40%非变性聚丙烯酰胺的试剂瓶，在容器孔十中放置装有去离子水的试剂瓶。上述试剂瓶的大小均与容器孔的大小相适应。在长方型凹槽中放置血样DNA承载滤纸。

PCR反应液为：以20μl PCR反应体系计为：10×buffer缓冲液2μL，5×Q溶液2μL，3 μM MgCl₂ 1.2μL，150 μM dNTPs1.2μL，0.25 μM上下游混合引物1μL，0.5 U Taq聚合酶0.1μL和12.5μL的ddH₂O。

其中的引物为：ADIPOQ-F：5’-TTCCTGCTTCTGATCTTGACC-3’；

ADIPOQ-R：5’-CAGCCTAGAAATTGAATCAGTC-3’。

SSCP上样变性缓冲液为：98%去离子甲酰胺、10mM EDTA、0.025%溴酚蓝和0.025%二甲苯青。

上述试剂盒构造简单、美观，取用方便，将在不同步骤时使用到的试剂分类放置，使得使用时方便快捷。

该试剂盒的使用方法参照实施例1。

最后应说明的是：以上所述仅为本实用新型的优选实施例而已，并不用于限制本实用新型，尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。

序列表

<110> 铜仁学院

<120> 一种检测绵羊胴体肌肉性状的试剂盒

<210> 1

<211> 372

<212> DNA

<213> 绵羊ADIPOQ的等位基因A

<400> 1

ttcctgcttc tgatcttgac ccttggtccc atcttctgtt gctgttgtaa gaggcaaaaa 60

taaaggccaa agcctggaga cataagtgtg atgcctgcag ctctacttgg catcctaagc 120

ccgaattggg ttgcaccagg ttccctcggg tggcaaccca agggagctgc caggggctgt 180

gtctacccat tggtctctgg ttctcactgt gctggccaat gggaagggac agtggtgagg 240

cggggtctgc ttacccccat gagtaccggg ccactgaggc caggccatcg cctcttactt 300

ccacactgac cgaagtctgt ggctctgatt ccacacctga gggtaaggat gactgattca 360

atttctaggc tg 372

<210> 2

<211> 372

<212> DNA

<213> 绵羊ADIPOQ的等位基因B

<400> 2

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<210> 3

<211> 372

<212> DNA

<213> 绵羊ADIPOQ的等位基因C

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<210> 4

<211> 372

<212> DNA

<213> 绵羊ADIPOQ的等位基因D

<400> 4

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