单核苷酸检测方法与流程

遗传物质的下一代测序已经在整体上对生物科学和药物产生了重大影响，特别是因为测序的单位成本随着越来越快测序机器的上市而降低。

在我们先前的申请WO2014/053853，WO2014/053854，WO2014/167323，WO2014/167324和WO2014/111723中，我们描述了一种新的测序方法，其涉及逐步消化多核苷酸分析物以产生有序的单核苷酸流，优选单个脱氧核糖核苷三磷酸的流，其中的每一个可以逐个地捕获到微滴流中的相应液滴中。此后，可以对每个液滴进行化学和/或酶促操作以显示其最初包含的特定单核苷酸。在一个实施方案中，这些化学和/或酶促操作包括涉及使用一种或多种双组分寡核苷酸探针类型的方法，每种探针类型适于能够选择性地捕获构成分析物的单核苷酸类型之一。通常，在每种这样的探针类型中，两个寡核苷酸组分之一包含特征荧光团，并且在探针未使用状态下，这些荧光团发荧光的能力由于存在靠近的淬灭剂或通过自淬灭而保持熄灭。在使用中，当探针捕获其相应的单核苷酸时，其易于进行随后的外切核酸降解，从而从淬灭剂和/或彼此释放荧光团使其能够自由发荧光。通过这种方式，可以通过分光镜手段间接地鉴定每个液滴中存在的原始单核苷酸。

Fan等人在Nature Reviews Genetics 7(8)632-644(2006)中提供了对方法和平台开发的一般性综述，这些方法和平台已经能够进行高度平行的基因组分析，用于基因分型，拷贝数测量，测序和检测杂合性缺失，等位基因特异性表达和甲基化。该综述的图2a示意性地显示了具有3’和5’末端的可环化探针的使用，其在分析物上的单核苷酸多态性(SNP)位点的上游和下游退火，从而留下缺口，所述缺口随后用作为SNP的互补体的核苷酸填充，形成完整的环状探针，然后其可以在释放后进行扩增。然而，与我们的方法不同，在填充过程中捕获的核苷酸不是直接从分析物本身获得。

WO03080861公开了一种方法，其中核酸分析物在核苷酸特异性反应性标记存在下经历渐进的焦磷酸解，所述核苷酸特异性反应性标记在核苷酸释放时直接连接至核苷酸。这不仅与我们采用的方法完全不同，而且在实践中，当标记的核苷酸随后被查询时测量的荧光信号可能太弱而不能在相关的背景噪声之上进行可靠的鉴定。

最后，WO9418218教导了一种DNA测序方法，其中分析物经历渐进的外切核酸降解以产生单核苷酸二磷酸或单核苷酸单磷酸流，然后在检测之前将其掺入荧光增强基质中。这不仅是与我们所描述的方法完全不同的方法，而且我们再次观察到所产生的任何信号可能太弱而无法可靠地检测和鉴定。

在我们的申请WO 2016/012789中，我们公开了在我们的上述专利申请中描述的新版本的测序方法，其涉及改进的探针系统。在该方法中，带有例如处于不可检测状态的荧光团的第一单链寡核苷酸在聚合酶和连接酶存在下经历与待捕获的核苷酸和第二和第三单链寡核苷酸的反应，以产生双链的已用探针，其中仅包含第一寡核苷酸的链易于外切核酸降解。这使得在捕获期间产生的另一条链能够参与第一寡核苷酸退火和外切核酸降解步骤的循环，使得来自释放的荧光团(现在处于可检测状态)的信号随着每个循环快速增长并且变得更容易检测。在一个实施方案中，第二和/或第三寡核苷酸的3’端通过化学修饰或优选连接各自的相关末端而对外切核酸降解具有抗性，使得当核苷酸被捕获时这些寡核苷酸所位于其中的已用探针的链呈现闭环。

我们现在已经开发了本专利申请中描述的探针系统和方法的改进版本，其使得可以区分其中相关核碱基被取代或未被取代(例如甲基化或未甲基化)的核苷酸。这使得该方法特别适用于例如检测序列中甲基化胞嘧啶或腺嘌呤核碱基的位置。这是非常有益的，因为在某些情况下，已知这种甲基化的位置与遗传病症和诸如癌症的疾病相关。

因此，根据本发明的第一方面，提供了对核酸进行测序的方法，其特征在于以下步骤：(1)通过核酸的渐进的焦磷酸解产生单核苷酸流；(2)通过在聚合酶和连接酶存在下使单核苷酸之一与相应的探针系统反应产生至少一个基本上双链的寡核苷酸已用探针，所述探针系统包含(a)第一单链寡核苷酸，其标记有处于不可检测状态的特征性可检测元件类型的第一和第二区，所述第一和第二区分别位于第三区的X’和Y’端侧，所述第三区包含包括捕获位点的限制性酶识别位点元件和在其X’侧的外切核酸酶阻断位点(其中X’为3’并且Y’为5’或X’为5’并且Y’是3’)，和(b)第二和第三单链寡核苷酸，其能够与第一寡核苷酸上捕获位点侧翼的互补区杂交；(2a)(i)当且仅当捕获的单核苷酸包含被取代的核碱基时，用常规或切口取代依赖性限制性内切核酸酶处理已用探针以在识别位点切割第一寡核苷酸链，或(ii)当且仅当捕获的单核苷酸包含未取代的核碱基时，用常规或切口取代敏感性限制性内切核酸酶处理已用探针以在识别位点切割第一寡核苷酸链；(3)用在对应于第一寡核苷酸的X’-Y’方向上具有双链外切核酸活性的酶消化已用探针的第一寡核苷酸链以产生处于可检测状态的来自第一区，第二区，或第一和第二区的可检测元件和单链第四寡核苷酸，所述单链第四寡核苷酸至少部分是第一寡核苷酸的互补序列；(4)使第四寡核苷酸与另一个第一寡核苷酸反应以产生对应于已用探针的基本上双链的寡核苷酸产物；(5)在循环中重复步骤(2a)，(3)和(4)，并且(6)检测在步骤(3)的每次重复中释放的可检测元件，其中如果使用的内切核酸酶是常规类型，则第二或第三寡核苷酸分别在其X’或Y’端或其附近包括引导内切核酸降解的连接。

本发明方法的步骤(1)包括通过焦磷酸解从核酸分析物产生单核苷酸(此处为单核苷三磷酸)流。在该步骤中使用的分析物合适地是双链多核苷酸，其长度原则上可以是没有限制的，包括在人基因组片段中发现的高达数百万个核苷酸碱基。然而，通常多核苷酸长度至少为50，优选至少150个核苷酸对；适当地，它将大于500，大于1000，并且在许多情况下长数千个核苷酸对。尽管该方法也可用于对合成产生的RNA或DNA或全部或部分由在自然界中不常遇到的核碱基(即除腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶外的核碱基)构成的其他核酸进行测序，但分析物本身适合是天然来源(例如来源于植物，动物，细菌或病毒)的RNA或DNA。这种核碱基的实例包括4-乙酰基胞苷，5-(羧基羟甲基)尿苷，2-O-甲基胞苷，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨基-甲基尿苷，二氢尿苷，2-O-甲基假尿苷，2-O-甲基鸟苷，肌苷，N6-异戊基腺苷，1-甲基腺苷，1-甲基假尿苷，1-甲基鸟苷，1-甲基肌苷，2,2-二甲基鸟苷，2-甲基腺苷，2-甲基鸟苷，3-甲基胞苷，5-甲基胞苷，N6-甲基腺苷，7-甲基鸟苷，5-甲基氨基甲基尿苷，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷，5-甲氧基尿苷，5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷，5-甲氧基羰基甲基尿苷，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷，尿苷-5-氧基乙酸-甲酯，尿苷-5-氧基乙酸，wybutoxosine，wybutosine，假尿苷，q核苷，2-硫胞苷，5-甲基-2-硫尿苷，2-硫尿苷，4-硫尿苷，5-甲基尿苷，2-O-甲基-5-甲基尿苷和2-O-甲基尿苷。在DNA的情况下，产生的单核苷酸是脱氧核糖核苷三磷酸，而在RNA的情况下，它们是核糖核苷三磷酸。

在本发明的一个实施方案中，步骤(1)包括将分析物连接到基底上的第一子步骤。通常，基底包括微流体表面，微珠或可渗透膜；例如，由玻璃或不可降解的聚合物制成的。优选地，基底还包括适于接收分析物的表面。有许多方法可以将分析物连接到这样的表面上，其中任何一个原则上都可以用在这个子步骤中。例如，一种方法涉及用官能化硅烷例如环氧硅烷，氨基烃基硅烷或巯基硅烷涂布玻璃表面。然后可以用分析物的衍生物处理如此产生的反应位点，所述分析物的衍生物已被修饰以包括末端胺，琥珀酰基或硫醇基。

在步骤(1)的一个实施方案中，对分析物进行渐进的焦磷酸解以产生单核苷酸流，其顺序对应于分析物序列的顺序。焦磷酸解可以在包含聚合酶的反应介质存在下，在20至90℃的温度进行。优选地，它在连续流动的条件下进行，使得单核苷酸在释放时连续地从反应区中除去。最优选地，通过使含有酶和其它典型添加剂的含水缓冲介质连续流过分析物所结合的表面来进行焦磷酸解。

在一个实施方案中，使用的酶是可以引起分析物的渐进的3’-5’焦磷酸解降解以高保真度和合理反应速率产生核苷酸流的酶。优选地，该降解速率尽可能快，并且在一个实施方案中，其为每秒1至50个核苷酸。关于应用于多核苷酸降解的焦磷酸解反应的进一步信息可以在例如J.Biol.Chem.244(1969)pp.3019-3028中找到。合适地，焦磷酸解在介质存在下进行，该介质还包含焦磷酸根阴离子和镁阳离子；优选以毫摩尔浓度。

在本发明方法的步骤(2)中，在聚合酶和连接酶存在下，所述流中的至少一个单核苷酸、优选有序流中的每个单核苷酸与探针系统反应，以产生基本上双链的已用探针。在一个实施方案中，在进行该步骤之前，用焦磷酸酶处理步骤(1)的产物，以将任何残留的焦磷酸盐水解成磷酸根阴离子。

在该步骤中使用的聚合酶在一个实施方案中选自由以下组成的组：在反应条件下基本上既不显示外切核酸酶活性也不显示内切核酸酶活性的聚合酶。可以有利地使用的聚合酶的实例包括但不限于从细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)(例如Klenow片段聚合酶)，水生栖热菌(Thermus aquaticus)(例如Taq Pol)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)，Bacillus caldovelox和热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)获得的原核pol 1酶或酶衍生物。在该步骤中可以使用任何合适的连接酶。

步骤(2)中采用的探针系统由三个组分组成；(a)用处于不可检测状态的不同可检测元件类型的第一和第二区标记的第一单链寡核苷酸和(b)能够与第一寡核苷酸上捕获位点的任一侧的互补区杂交的第二和第三未标记单链寡核苷酸。在一个实施方案中，其中限制性内切核酸酶不是切口(nicking)内切核酸酶，第二和/或第三寡核苷酸包括分别位于其X’或Y’端或其附近的引导内切核酸降解的连接(linkage)，使得最终该连接包含在已用探针中产生的限制性酶识别位点的一部分。在一个实施方案中，该引导内切核酸降解的连接是硫代磷酸酯连接。另一方面，它是选自由以下组成的组的一种：亚磷酰胺连接如C3间隔(spacer)，间隔9，间隔12，间隔18，d-间隔(无碱基呋喃型)或其他类似间隔或寡核苷酸合成中核苷酸之间使用的修饰。

在一个实施方案中，第二和第三寡核苷酸是离散的实体，而在另一个实施方案中，它们通过接头区彼此连接。在另一个实施方案中，接头区将第二寡核苷酸的Y’端和第三寡核苷酸的X’端连接在一起，此处和下文中的术语X’和Y’相对于步骤(3)中发生的外切核酸降解的方向而使用。该接头区原则上可以是任何二价基团，但是方便地是另一个单链或双链寡核苷酸片段。在一个实施方案中，接头区基本上不能与第一寡核苷酸杂交。

第一寡核苷酸还包括具有处于不可检测状态的不同可检测元件的第一和第二区，所述第一和第二区在位于其间的第三区的X’和Y’端侧上，所述第三区包括上述捕获位点。该捕获位点包含单核苷酸，其核碱基与待检测核苷酸所携带的核碱基互补，使得探针系统对该特定核苷酸具有高选择性。因此，例如，如果分析物衍生自DNA并且第一，第二和第三寡核苷酸是脱氧核糖核苷酸，则如果捕获位点核苷酸带有胸腺嘧啶碱基，则捕获位点对脱氧腺苷三磷酸具有高度选择性。因此，在本发明的一个有用的实施方案中，步骤(2)可以在多个探针系统类型的存在下进行；例如，一个，两个，三个或四个探针系统类型，每个探针系统类型包含第一寡核苷酸，其具有(a)所寻求的各种不同核碱基所特有的不同捕获位点核苷酸和(b)不同的相关的可检测元件。在一个实施方案中，所有第一寡核苷酸都是本文所述的类型。在另一个实施方案中，使用这种类型中的至少一个与WO 2016/012789中描述的一种或多种第一寡核苷酸的混合物。

捕获位点本身形成限制性位点元件的一部分，其能够在形成已用探针时产生限制性酶识别位点。通常，限制性位点元件长4至8个核苷酸，但原则上它可以是任何长度。

第三区还包括外切核酸酶阻断位点，其设计为在达到识别位点之前停止步骤(3)中已用探针的第一寡核苷酸链的X’-Y’核酸外切消化。通过这种方式，如果已用探针的第一寡核苷酸链在识别位点被切割，则与第一和第二区相关的可检测元件只能以可检测的形式释放。因此，该外切核酸酶阻断性元件适当地位于第三区的限制性位点元件的X’端侧的主链中。它合适地是选自以下的元件：硫代磷酸酯连接，G-Quadruplex，硼酸化核苷酸，反向dT或ddT，C3间隔，磷酸基团或通常可用作内部寡核苷酸修饰的各种外切核酸酶抑制性接头或间隔中的任一种。

通常，第一寡核苷酸长达150个核苷酸，优选20到100个核苷酸。在一个实施方案中，第二寡核苷酸比第一寡核苷酸的互补X’侧侧翼区长多达10个核苷酸，优选1至5个核苷酸。在另一个实施方案中，在第一寡核苷酸的3’端与在第二或第三寡核苷酸上与其相对的核苷酸之间存在单核苷酸错配，以防止在此点处聚合酶捕获核苷三磷酸。在另一个实施方案中，第三寡核苷酸的X’端包括对核酸外切降解具有抗性的元件，以确保步骤(3)中产生的第四寡核苷酸本身不随后被消化。这可以例如通过在所述特定末端处或附近掺入一个或多个硫代磷酸酯连接，G-Quadruplex，硼化核苷酸，反向dT或ddT，C3间隔，磷酸基团或通常可用的各种外切核酸酶抑制性接头和间隔中的任一种来实现。

第一寡核苷酸的特征在于其被第一和第二可检测元件区标记，每个可检测元件区被其自身独特且特有类型的可检测元件标记，优选地被多重标记，并且当探针系统处于未使用状态时这些可检测元件基本上不可检测。适当地，这些可检测元件是适于在发生光学事件之后被检测的元件。在一个优选的实施方案中，可检测元件包含荧光团，并且每个未使用的第一寡核苷酸在被设计为检测所述荧光团的那些波长处基本上不发荧光。因此，尽管荧光团可以在大部分电磁光谱中显示出一般的低水平背景荧光，但通常会有荧光强度最大的一个或少量特定波长或波长包络(envelope)。在特征性地检测荧光团的这些最大值中的一个或多个处基本上不应发生荧光。在该专利的上下文中，术语“基本上不发荧光”或等同措辞是指连接于第一寡核苷酸的荧光团总数在相关特征波长或波长包络处的荧光强度小于25％；优选小于10％；更优选小于1％，最优选小于0.1％的相应数量的游离荧光团的相应荧光强度。

如果在给定的第一和/或第二区中使用荧光团，则原则上可以使用任何方法来确保在第一寡核苷酸的未使用状态下它们基本上不发荧光。一种方法是在它们附近另外连接淬灭剂。另一个是基于以下观察结果：当多个荧光团彼此紧密接近时，它们倾向于彼此足够好地淬灭，使得可以在不需要淬灭剂的情况下实现前一段中描述的标准。在该专利的上下文中，荧光团之间或荧光团与淬灭剂之间的“紧密接近”构成取决于所用的特定荧光团和淬灭剂以及可能地第一寡核苷酸的结构特征。因此，该术语旨在参考所要求的结果而不是各种元件的任何特定结构布置来解释。然而，并且仅出于提供示例的目的，指出的是，当相邻的荧光团或相邻的荧光团和淬灭剂分开的距离对应于特征距离(通常小于5nm)时，通常将实现足够的淬灭。

合适地，每个第一和第二区用至少1个，优选多达20个荧光团标记。为了获得最大的优点，优选每个区用至少2个，优选至少3个荧光团标记。因此，本文具体设想了由这些最大和最小数字的任何排列构成的范围。如果使用淬灭剂，同样优选每个区用多达20个，优选多达10个，最优选多达5个荧光团进行标记。

关于荧光团本身，它们原则上可以选自本领域常规使用的任何一种，包括但不限于呫吨部分，例如荧光素，罗丹明及其衍生物，例如异硫氰酸荧光素，罗丹明B等；香豆素部分(例如羟基-，甲基-和氨基香豆素)和花菁部分如Cy2，Cy3，Cy5和Cy7。具体实例包括衍生自以下常用染料的荧光团：Alexa染料，花菁染料，Atto Tec染料和罗丹明染料。实例还包括：Atto 633(ATTO-TEC GmbH)，Texas Red^TM，Atto 740(ATTO-TEC GmbH)，Rose Bengal，Alexa Fluor^TM 750 C5-马来酰亚胺(Invitrogen)，Alexa Fluor^TM 532C2-马来酰亚胺(Invitrogen)和罗丹明红C2-马来酰亚胺和罗丹明绿以及亚磷酰胺染料例如Quasar 570。备选地，可以使用量子点或近红外染料，例如由LI-COR Biosciences提供的那些。荧光团通常使用本领域已知的化学方法经由核苷酸碱基与第一寡核苷酸连接。

合适的淬灭剂包括通过共振能量转移(FRET)机理起作用的淬灭剂。可与上述荧光团结合使用的市售淬灭剂的实例包括但不限于DDQ-1，Dabcyl，Eclipse，Iowa Black FQ和RQ，IR Dye-QC1，BHQ-0，BHQ-1，-2和-3和QSY-7和-21。

在一个实施方案中，第二和第三寡核苷酸未用可检测元件标记。

步骤(2)适当地通过使流中的每个单核苷酸与一个或多个如上所述的探针系统在20至80℃的温度接触来进行。

如上所述，本发明方法的步骤(2)的产物是基本上双链的已用探针，其组成链分别是第一寡核苷酸和互补的第四寡核苷酸，当在所述第四寡核苷酸的Y’-X’方向读取时，其由第二寡核苷酸，捕获的核苷酸和最后的第三寡核苷酸构成。因此，如果第二和第三寡核苷酸先前已经通过接头区连接在一起，则显而易见的是，第四寡核苷酸将包含对核酸外切具有高度抗性的闭环链。

在步骤(2a)中，用取代依赖性或取代敏感的限制性内切核酸酶处理已用探针，以使该方法能够检测单核苷酸中核碱基取代(例如烷基，氨基，硝基，卤化物，硫或类似取代)的存在或不存在。通过这种方式，该方法可用于例如检测甲基化核碱基的存在或不存在，尽管这不应被解释为限制。在该特定应用中，当且仅当捕获的单核苷酸包含甲基化或非甲基化核碱基(视情况而定)时，甲基化依赖性或甲基化敏感性限制性内切核酸酶优选在高达70℃的温度用于在识别位点切割第一寡核苷酸链。例如，甲基化敏感性内切核酸酶MspI和Hpall仅在具有序列5’--CC*GG--3’的识别位点切割双链寡核苷酸，其中C*是非甲基化胞嘧啶，DnpI内切核酸酶仅在具有序列5’--GA*TC--3’的识别位点切割，其中A*是甲基化腺嘌呤。该步骤的一个重要特征是，由于限制性酶是切口内切核酸酶，或者由于来自另一条链中的第二或第三寡核苷酸的引导内切核酸降解的连接的存在，只有已用探针的第一寡核苷酸链被内切核酸酶切割。因此，如果使用的内切核酸酶是甲基化依赖性的并且捕获位点捕获的单核苷酸被甲基化，则限制性内切核酸酶将已用探针的第一寡核苷酸链切割成两个，使得第一和第二区在步骤(3)中易于消化，而如果捕获的单核苷酸未甲基化，则限制性酶将没有作用，并且第一寡核苷酸链的消化将继续沿X’-Y’方向进行直至被外切核酸酶阻断位点终止。因此，只有与第一区相关的可检测元件才将以可检测的形式释放。相反，如果使用的内切核酸酶是甲基化敏感的并且捕获的单核苷酸是非甲基化的，则限制性内切核酸酶将已用探针的第一寡核苷酸链切成两个，使得第一和第二区在步骤(3)中易于消化，而如果捕获的单核苷酸被甲基化，则限制性酶将没有作用，并且第一核苷酸链的消化将继续沿X’-Y’方向进行直至被外切核酸酶阻断位点终止。因此，只有与第一区相关的可检测元件才将以可检测的形式释放。这意味着在步骤(6)中，当使用甲基化依赖性限制性酶时，如果捕获的单核苷酸被甲基化，则观察者将检测两种类型的可检测元件，如果它是未甲基化的则仅检测第二种类型，当使用甲基化敏感性限制性酶时则是相反的情况。在另一个实施方案中，限制性位点处的切割允许包含第一区的寡核苷酸片段熔解，导致仅第二区被消化，而缺乏切割再次导致仅消化第一区。

在步骤(3)中，步骤(2a)的产物用酶在30至100℃的温度处理。在该步骤中，在将可检测元件彼此分开并使它们变得未被淬灭并因此可检测到的过程中，来自第一寡核苷酸已用探针链的链或部分在X’-Y’方向上被消化成它们的构成核苷酸(视情况而定的脱氧核糖核苷单磷酸或核糖核苷单磷酸)。因此，如果可检测元件是在第一寡核苷酸中已被淬灭到不可检测状态的荧光团，则步骤(3)将使荧光团从彼此和任何淬灭剂释放，从而使它们发荧光。随着消化过程的发生，由于产生了荧光团级联，观察者因此看到荧光信号的快速增长。然后，该荧光的特征间接反映了相关探针系统最初捕获的单核苷酸的性质。

可用于步骤(3)的酶包括外切核酸酶或表现出3’-5’或5’-3’外切核酸活性的聚合酶。3’-5’类酶包括Q5，Q5Hot Start，Phusion，Phusion HS，Phusion II，Phusion II HS，Dnase I(无RNase)，外切核酸酶I或III(来自大肠杆菌)，外切核酸酶T，外切核酸酶V(RecBCD)，λ外切核酸酶，微球菌核酸酶，绿豆核酸酶，核酸酶BAL-31，RecJf，T5外切核酸酶和T7外切核酸酶。步骤(3)优选在60-90℃的温度进行。

在一个实施方案中，在步骤(3)结束时并且在步骤(4)之前，优选将反应混合物加热至80-100℃的温度，以从第四寡核苷酸中除去消化后留下的任何连接的残留寡核苷酸片段。

在步骤(4)中，使现在以单链形式存在的第四寡核苷酸与另一个第一寡核苷酸分子杂交，从而产生新的基本上双链的寡核苷酸产物，其对应于，即具有与已用探针相同的化学和物理结构的寡核苷酸。然后在步骤(2a)和(3)的重复中消化该产物，从而释放可检测状态的其他可检测元件，并再次再生第四寡核苷酸。此后，根据步骤(5)，允许步骤(2a)，(3)和(4)以循环方式继续，从而引起来自自由可检测元件的信号例如荧光信号的进一步增强，原则上直到基本上全部第一寡核苷酸被消耗为止。结果，观察者看到荧光信号比先前获得的更大的增强。

此后，并且在步骤(6)中，检测在步骤(3)的不同重复中释放的可检测元件，并确定连接至原始单核苷酸的核碱基的性质。通过系统地对步骤(1)中产生的流中的所有单核苷酸实施本发明的方法，因此可以产生原始核酸分析物的序列的数据特征并且定位甲基化位点。进行这种检测的方法在本领域中是众所周知的；例如，可以使用光电探测器或调谐到各种荧光团类型的特征荧光波长或波长包络的等效装置来检测荧光。这又使光电探测器产生特征电信号，该特征电信号可以使用已知算法在计算机中处理和分析。在一个实施方案中，允许在步骤(5)和(6)之间经过一段时间，以确保处于可检测状态的可检测元件的数量已经增长到最大。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法全部或部分地在微滴流中进行，其中至少一些微滴包含单个核苷酸；适当地是有序流。这种方法可以例如通过将步骤(1)中产生的核苷酸逐个地插入保持在不混溶的载体溶剂(如烃或硅油)中的相应含水微滴流中来开始，以帮助保持有序。有利地，这可以通过在焦磷酸解反应区下游直接产生微滴来实现；例如，通过使反应介质从适当尺寸的微滴头出现进入到流动的溶剂流中。备选地，可以将来自步骤(1)的反应介质的小等分试样有规律地和顺序地注入悬浮在溶剂中的已存在的含水微滴的流中。如果采用后一种方法，则每个微滴可以已经含有探针系统的各种组分以及实现步骤(2)-(5)所需的酶和任何其他试剂(例如缓冲液)。在另一种方法中，可以使在前一实施方案中产生的微滴随后与这种已存在的微滴流聚合以实现类似的结果。在这些微滴方法中，步骤(6)然后优选包括查询每个微滴以鉴定释放的可检测元件，并因此鉴定其最初包含的核苷三磷酸的性质。然而，在最优选的实施方案中，将来自步骤(1)的所有反应介质作为一系列微滴印刷到在任选地包括孔等的表面上的液滴接收位置处覆盖有载体溶剂的可移动表面上。此后，可以将上述其他组分以另外的含水微滴的形式依次引入每个位置，所述含水微滴与原始反应介质进行聚合。如果需要，可以仅在孵育期过后引入这些另外的含水微滴。如果采用这种方法，则步骤(6)涉及依次查询每个液滴接收位置。

在任何这些方法中，为了避免给定微滴含有多于一个核苷酸的风险，优选以一定速率释放步骤(1)中的每个核苷酸，使得每个填充的微滴平均分开1至20个，优选2个至10个空微滴。合适地，所用微滴的有限直径小于100微米，优选小于50微米，更优选小于20微米，甚至更优选小于15微米。最优选地，它们的所有直径都在2至20微米的范围内。在一个实施方案中，通过整个系统的微滴生成速率为每秒50至3000个微滴，优选100至2000个微滴。

根据本发明的第二方面，提供了一种多组分生物探针系统，其特征在于包括(a)第一单链寡核苷酸，其标记有处于不可检测状态的不同可检测元件类型的第一和第二区，所述第一和第二区分别位于第三区的X’和Y’端侧，所述第三区包含与DNA或RNA的核碱基之一互补的单核苷酸捕获位点，具有(1)相关的限制性酶识别位点元件和(2)其X’侧的外切核酸酶阻断位点，以及(b)第二和第三未标记的单链寡核苷酸，其能够分别与第一寡核苷酸上的捕获侧翼的互补X’和Y’侧区杂交，其中X’为3’并且Y’为5’或X’为5’并且Y’是3’。

在第一个实施方案中，第三寡核苷酸在其Y’端或其附近包括引导内切核酸降解的连接。在另一个实施方案中，第二寡核苷酸在其X’端或其附近具有类似的连接。在一个实施方案中，该连接是硫代磷酸酯连接。另一方面，它是选自由以下组成的组的一种：亚磷酰胺连接如C3间隔，间隔9，间隔12，间隔18，d-间隔(无碱基呋喃型)或其他类似间隔或寡核苷酸合成中核苷酸之间使用的修饰。优选地，第二寡核苷酸的Y’端和第三寡核苷酸的X’端通过接头区适当地通过单链或双链寡核苷酸区连接。在另一个实施方案中，第一和第二区中的可检测元件是任选地在淬灭剂存在下的上述类型的荧光团。在另一个实施方案中，第二寡核苷酸长于第一寡核苷酸的X’侧翼区。优选地，第一寡核苷酸的3’端的核苷酸与第二或第三寡核苷酸中的相应核苷酸错配。

当第二或第三寡核苷酸不通过接头区连接时，第二和/或第三寡核苷酸合适地还包括在其X’端对核酸外切降解具有抗性的元件。

上述方法和探针系统可以有利地用于测序装置，并且预期这些装置和用途在本发明的范围内。

现在将参考以下实施例说明本发明的各个方面。

实施例1-探针系统的制备和使用

制备单链的第一寡核苷酸1，其具有以下核苷酸序列：

其中A，C，G和T代表带有DNA相关特征核苷酸碱基的核苷酸；X代表用Atto 655染料标记的脱氧胸苷核苷酸(T)，Q代表用BHQ-2淬灭剂标记的脱氧胸苷核苷酸，Y代表用Atto 532染料标记的脱氧胸苷核苷酸，Z代表用BHQ-1淬灭剂标记的脱氧胸苷核苷酸，/C3/代表C3间隔修饰，/mC/代表5-甲基胞嘧啶核苷酸，并且*代表己二醇修饰。它还包含捕获区(G核苷酸)，其选择性捕获脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)混合物中的脱氧胞嘧啶三磷酸核苷酸(dCTP)。

还制备了另外两个单链寡核苷酸2和3，每个具有与寡核苷酸1的区互补的区，当寡核苷酸2和3都与其退火时，在寡核苷酸1的捕获区形成单碱基缺口。寡核苷酸2具有以下核苷酸序列：

其中**代表硫代磷酸酯连接。寡核苷酸3具有以下序列：

其中P代表5’磷酸基团以及/IdT/代表3’反向dT碱基。

然后制备包含探针系统的反应混合物。它具有与衍生自以下配方的组成相对应的组成：

20nM寡核苷酸1

10nM寡核苷酸2

50nM寡核苷酸3

10nM dCTP，5mdCTP或等量的水

1x缓冲液pH 7.6

1.4反应/mL Pfu Ultra Fusion II Hot Start聚合酶

57U/mL Bst大片段聚合酶

71U/mL大肠杆菌连接酶

3.6U/mL AOXI

14U/mL热稳定无机焦磷酸酶

其中5x缓冲液包含以下混合物：

60uL 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Trizma hydrochloride)，1M，pH 7.6

33.3uL KCl，3M

25uL MgCl2水溶液, 1M

20uL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，100μM

2.5uL二硫苏糖醇，1M

50uL Triton X-100表面活性剂(10％)

加水至1mL

然后通过将混合物在37℃温育10分钟，然后将温度升至60℃再保持20分钟，进行dCTP或5mdCTP的捕获和寡核苷酸2与寡核苷酸3的连接。然后将温度升至95℃保持30秒，最后降至70℃保持90分钟。然后使用633nm的氦-氖激光线和532nm的二极管激光线照射反应混合物，并使用照相机检测所得的Atto 655和Atto 532染料的特征荧光。

监测在反应的dNTP组分存在下荧光强度随时间的增长，并且结果在图1和2中以图形方式显示。从这些可以看出，探针系统有效地捕获dCTP和5mdCTP。在存在dCTP的情况下，仅在Atto 655通道中观察到荧光信号，而在存在5mdCTP的情况下，在Atto 655和Atto 532通道中都观察到信号。在反应混合物中不存在dNTP的对比实验中，寡核苷酸1上的Atto655和Atto 532染料均未显示任何显著程度的荧光。