本发明涉及基因测序技术领域，尤其涉及一种全基因组甲基化高通量测序方法。
背景技术：
高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(nextgenerationsequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序(massivelyparallelsignaturesequencing,mpss)、聚合酶克隆(polonysequencing)、454焦磷酸测序(454pyrosequencing)、illumina(solexa)sequencing、abisolidsequencing、离子半导体测序(ionsemiconductorsequencing)、dna纳米球测序(dnananoballsequencing)等。随着现在科技的不断进步，现有的测序方法已经满足不了现在的发展速度。为此，我们提出了一种全基因组甲基化高通量测序方法。
技术实现要素：
本发明提出了一种全基因组甲基化高通量测序方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明提出了一种全基因组甲基化高通量测序方法，包括如下步骤：
s1：选取基因组，并利用限制性内切酶对基因组进行酶切，以便获得基因组片段，并将获取的基因组片段置于零下15-零下8摄氏度的条件下进行放置，放置环境需为无菌环境；
s2：在放置36-48h后，将基因组片段取出，并置于5-8摄氏度的环境中，然后将所述基因组片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的基因组片段，修复后的基因组片段再次放置在器皿内，并向器皿内添加亚硫酸盐，且亚硫酸盐需漫过基因组片段，并对基因组片段进行实时晃动，从而使其均匀接触，待其放置4-7min后，则完成对基因组片段的修饰，从而形成基因组测序样本；
s3：将s2中形成的基因组测序样本，对样本上的ccgg位点进行确定，然后连接上ccgg位点的接头，随后用mmei酶切，可得到一段包含hpaii酶切位点的18-19bp的标签序列，在用连接酶连接上基因组测序样本上的第二个接头，然后对其进行扩增，且扩增的温度为25-35摄氏度；
s4：将s3中扩增后的基因组测序样本使用ptp平板，且ptp平板含有160万个光纤孔，在测序反应中，每个光纤孔内都固定有测序模板，且测序模板表面放置有atp硫化酶以及荧光素酶，测序开始时，a、t、c、g四种碱基依照固定顺序依次循环进行入ptp平板，且每次只进入一个碱基，在atp硫化酶的作用下，生成的ppi和磷酰硫酸结合形成atp，在荧光素酶的催化下，生成的atp和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光；
s5：在s4中反应所释放的光信号被高灵敏度的ccd捕获，并生成测序图像，从而获得待测模板的测序信息。
优选的，在s2中的修饰过程中，必须保证ph值的准确度。
优选的，在s3中的扩增具体步骤如下：将基因组测序样本利用微乳液pcr在固定有扩增引物的微球表面上延伸待测模板，扩增时，每个液滴就相当于一个扩增反应器，并包括一个微球、一条模板以及扩增酶，扩增完成时，成功扩增的微球表面存在2*107-5*107个克隆。
优选的，在s5中待测模板需完全被聚合为双链。
优选的，在s2中对基因组片段进行末端修复前，需要预先对基因组片段进行纯化，以保证基因组片段的干净度。
本发明提出的一种全基因组甲基化高通量测序方法，有益效果在于：该全基因组甲基化高通量测序方法能够对基因组进行准确的测序，在测序前，能够对基因组进行多次预处理，从而有效保证了测序的效率以及质量，通过多种酶的使用，能够将基因组序列显示在我们眼前，符合现在发展的需求。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明提出了一种全基因组甲基化高通量测序方法，包括如下步骤：
s1：选取基因组，并利用限制性内切酶对基因组进行酶切，以便获得基因组片段，并将获取的基因组片段置于零下15摄氏度的条件下进行放置，放置环境需为无菌环境；
s2：在放置36h后，将基因组片段取出，并置于5摄氏度的环境中，然后将所述基因组片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的基因组片段，修复后的基因组片段再次放置在器皿内，并向器皿内添加亚硫酸盐，且亚硫酸盐需漫过基因组片段，并对基因组片段进行实时晃动，从而使其均匀接触，待其放置4min后，则完成对基因组片段的修饰，从而形成基因组测序样本；
s3：将s2中形成的基因组测序样本，对样本上的ccgg位点进行确定，然后连接上ccgg位点的接头，随后用mmei酶切，可得到一段包含hpaii酶切位点的18-19bp的标签序列，在用连接酶连接上基因组测序样本上的第二个接头，然后对其进行扩增，且扩增的温度为25摄氏度；
s4：将s3中扩增后的基因组测序样本使用ptp平板，且ptp平板含有160万个光纤孔，在测序反应中，每个光纤孔内都固定有测序模板，且测序模板表面放置有atp硫化酶以及荧光素酶，测序开始时，a、t、c、g四种碱基依照固定顺序依次循环进行入ptp平板，且每次只进入一个碱基，在atp硫化酶的作用下，生成的ppi和磷酰硫酸结合形成atp，在荧光素酶的催化下，生成的atp和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光；
s5：在s4中反应所释放的光信号被高灵敏度的ccd捕获，并生成测序图像，从而获得待测模板的测序信息。
在s2中的修饰过程中，必须保证ph值的准确度。
在s3中的扩增具体步骤如下：将基因组测序样本利用微乳液pcr在固定有扩增引物的微球表面上延伸待测模板，扩增时，每个液滴就相当于一个扩增反应器，并包括一个微球、一条模板以及扩增酶，扩增完成时，成功扩增的微球表面存在2*107个克隆。
在s5中待测模板需完全被聚合为双链。
在s2中对基因组片段进行末端修复前，需要预先对基因组片段进行纯化，以保证基因组片段的干净度。
实施例2
本发明提出了一种全基因组甲基化高通量测序方法，包括如下步骤：
s1：选取基因组，并利用限制性内切酶对基因组进行酶切，以便获得基因组片段，并将获取的基因组片段置于零下13摄氏度的条件下进行放置，放置环境需为无菌环境；
s2：在放置38h后，将基因组片段取出，并置于6摄氏度的环境中，然后将所述基因组片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的基因组片段，修复后的基因组片段再次放置在器皿内，并向器皿内添加亚硫酸盐，且亚硫酸盐需漫过基因组片段，并对基因组片段进行实时晃动，从而使其均匀接触，待其放置5min后，则完成对基因组片段的修饰，从而形成基因组测序样本；
s3：将s2中形成的基因组测序样本，对样本上的ccgg位点进行确定，然后连接上ccgg位点的接头，随后用mmei酶切，可得到一段包含hpaii酶切位点的18-19bp的标签序列，在用连接酶连接上基因组测序样本上的第二个接头，然后对其进行扩增，且扩增的温度为28摄氏度；
s4：将s3中扩增后的基因组测序样本使用ptp平板，且ptp平板含有160万个光纤孔，在测序反应中，每个光纤孔内都固定有测序模板，且测序模板表面放置有atp硫化酶以及荧光素酶，测序开始时，a、t、c、g四种碱基依照固定顺序依次循环进行入ptp平板，且每次只进入一个碱基，在atp硫化酶的作用下，生成的ppi和磷酰硫酸结合形成atp，在荧光素酶的催化下，生成的atp和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光；
s5：在s4中反应所释放的光信号被高灵敏度的ccd捕获，并生成测序图像，从而获得待测模板的测序信息。
在s2中的修饰过程中，必须保证ph值的准确度。
在s3中的扩增具体步骤如下：将基因组测序样本利用微乳液pcr在固定有扩增引物的微球表面上延伸待测模板，扩增时，每个液滴就相当于一个扩增反应器，并包括一个微球、一条模板以及扩增酶，扩增完成时，成功扩增的微球表面存在3*107个克隆。
在s5中待测模板需完全被聚合为双链。
在s2中对基因组片段进行末端修复前，需要预先对基因组片段进行纯化，以保证基因组片段的干净度。
实施例3
本发明提出了一种全基因组甲基化高通量测序方法，包括如下步骤：
s1：选取基因组，并利用限制性内切酶对基因组进行酶切，以便获得基因组片段，并将获取的基因组片段置于零下10摄氏度的条件下进行放置，放置环境需为无菌环境；
s2：在放置44h后，将基因组片段取出，并置于7摄氏度的环境中，然后将所述基因组片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的基因组片段，修复后的基因组片段再次放置在器皿内，并向器皿内添加亚硫酸盐，且亚硫酸盐需漫过基因组片段，并对基因组片段进行实时晃动，从而使其均匀接触，待其放置6min后，则完成对基因组片段的修饰，从而形成基因组测序样本；
s3：将s2中形成的基因组测序样本，对样本上的ccgg位点进行确定，然后连接上ccgg位点的接头，随后用mmei酶切，可得到一段包含hpaii酶切位点的18-19bp的标签序列，在用连接酶连接上基因组测序样本上的第二个接头，然后对其进行扩增，且扩增的温度为32摄氏度；
s4：将s3中扩增后的基因组测序样本使用ptp平板，且ptp平板含有160万个光纤孔，在测序反应中，每个光纤孔内都固定有测序模板，且测序模板表面放置有atp硫化酶以及荧光素酶，测序开始时，a、t、c、g四种碱基依照固定顺序依次循环进行入ptp平板，且每次只进入一个碱基，在atp硫化酶的作用下，生成的ppi和磷酰硫酸结合形成atp，在荧光素酶的催化下，生成的atp和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光；
s5：在s4中反应所释放的光信号被高灵敏度的ccd捕获，并生成测序图像，从而获得待测模板的测序信息。
在s2中的修饰过程中，必须保证ph值的准确度。
在s3中的扩增具体步骤如下：将基因组测序样本利用微乳液pcr在固定有扩增引物的微球表面上延伸待测模板，扩增时，每个液滴就相当于一个扩增反应器，并包括一个微球、一条模板以及扩增酶，扩增完成时，成功扩增的微球表面存在4*107个克隆。
在s5中待测模板需完全被聚合为双链。
在s2中对基因组片段进行末端修复前，需要预先对基因组片段进行纯化，以保证基因组片段的干净度。
实施例4
本发明提出了一种全基因组甲基化高通量测序方法，包括如下步骤：
s1：选取基因组，并利用限制性内切酶对基因组进行酶切，以便获得基因组片段，并将获取的基因组片段置于零下8摄氏度的条件下进行放置，放置环境需为无菌环境；
s2：在放置48h后，将基因组片段取出，并置于8摄氏度的环境中，然后将所述基因组片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的基因组片段，修复后的基因组片段再次放置在器皿内，并向器皿内添加亚硫酸盐，且亚硫酸盐需漫过基因组片段，并对基因组片段进行实时晃动，从而使其均匀接触，待其放置7min后，则完成对基因组片段的修饰，从而形成基因组测序样本；
s3：将s2中形成的基因组测序样本，对样本上的ccgg位点进行确定，然后连接上ccgg位点的接头，随后用mmei酶切，可得到一段包含hpaii酶切位点的18-19bp的标签序列，在用连接酶连接上基因组测序样本上的第二个接头，然后对其进行扩增，且扩增的温度为35摄氏度；
s4：将s3中扩增后的基因组测序样本使用ptp平板，且ptp平板含有160万个光纤孔，在测序反应中，每个光纤孔内都固定有测序模板，且测序模板表面放置有atp硫化酶以及荧光素酶，测序开始时，a、t、c、g四种碱基依照固定顺序依次循环进行入ptp平板，且每次只进入一个碱基，在atp硫化酶的作用下，生成的ppi和磷酰硫酸结合形成atp，在荧光素酶的催化下，生成的atp和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光；
s5：在s4中反应所释放的光信号被高灵敏度的ccd捕获，并生成测序图像，从而获得待测模板的测序信息。
在s2中的修饰过程中，必须保证ph值的准确度。
在s3中的扩增具体步骤如下：将基因组测序样本利用微乳液pcr在固定有扩增引物的微球表面上延伸待测模板，扩增时，每个液滴就相当于一个扩增反应器，并包括一个微球、一条模板以及扩增酶，扩增完成时，成功扩增的微球表面存在5*107个克隆。
在s5中待测模板需完全被聚合为双链。
在s2中对基因组片段进行末端修复前，需要预先对基因组片段进行纯化，以保证基因组片段的干净度。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。