本发明涉及糖蛋白检测领域，具体涉及一种用于糖蛋白检测的硼酸盐及其制备方法。
背景技术：
糖蛋白是含糖的蛋白质，由寡糖链与肽链中的一定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成。其主要生物学功能为细胞或分子的生物识别，如卵子受精时精子需识别卵子细胞膜上相应的糖蛋白。受体蛋白、肿瘤细胞表面抗原等亦均属糖蛋白。糖蛋白普遍存在于动物、植物及微生物中，种类繁多，功能广泛。可按存在方式分为三类:1、可溶性糖蛋白，存在于细胞内液、各种体液及腔道腺体分泌的粘液中。血浆蛋白除白蛋白外皆为糖蛋白。可溶性糖蛋白包括酶(如核酸酶类、蛋白酶类、糖苷酶类)、肽类激素(如绒毛膜促性腺激素、促黄体激素、促甲状腺素、促红细胞生成素)、抗体、补体、以及某些生长因子、干扰素、抑素、凝集素及毒素等。2、膜结合糖蛋白，其肽链由疏水肽段及亲水肽段组成。疏水肽段可为一至数个，并通过疏水相互作用嵌入膜脂双层中。亲水肽段暴露于膜外。糖链连接在亲水肽段并有严格的方向性。在质膜表面糖链一律朝外；在细胞内膜一般朝腔面。膜结合糖蛋白包括酶、受体、凝集素及运载蛋白等。此类糖蛋白常参与细胞识别，并可作为特定细胞或细胞在特定阶段的表面标志或表面抗原。3、结构糖蛋白，为细胞外基质中的不溶性大分子糖蛋白，如胶原及各种非胶原糖蛋白(纤粘连蛋白、层粘连蛋白等)。它们的功能不仅仅是作为细胞外基质的结构成分起支持、连接及缓冲作用，更重要的是参与细胞的识别、粘着及迁移，并调控细胞的增殖及分化。
寡糖链通常指由2-10个单糖基借糖苷键连成的聚合体。糖蛋白的寡糖链多有分枝。由于单糖的端基碳(异头碳)原子有α、β两种构型，而且单糖分子中存在多个可形成糖苷键的羟基，因此，糖链结构的多样性超过多核苷酸及肽链。在糖链结构中可以贮存足够的识别信息，从而在分子识别及细胞识别中起决定性作用。糖蛋白参与的生理功能包括凝血、免疫、分泌、内吞、物质转运、信息传递、神经传导、生长及分化的调节、细胞迁移、细胞归巢、创伤修复及再生等。糖蛋白的糖链还参与维持其肽链处于有生物活性的天然构象及稳定肽链结构，并赋予整个糖蛋白分子以特定的理化性质(如润滑性、粘弹性、抗热失活、抗蛋白酶水解及抗冻性等)。
糖蛋白与很多疾病如感染、肿瘤、心血管病、肝病、肾病、糖尿病以及某些遗传性疾病等的发生、发展有关。再者，细胞表面的糖蛋白及糖脂可"脱落"到周围环境或进入血循环，它们可以作为异常的标志为临床诊断提供信息；患某些疾病时体液中的糖蛋白亦常有特异性或强或弱的改变,这可有助于诊断或预后的判断。
欧洲专利EP0772779B1公开了一种糖蛋白检测方法，其利用硼酸盐与糖蛋白的特异性结合这一基本特征，设计带有特定吸收和激发荧光基团的硼酸盐化合物，并具体公开了采用通式为F-A-B(OH)2的化合物作为上述检测试剂。其中F是荧光素，A是-NH-CS-NH-Ph-基团，用以连接荧光素和硼酸基团，其化学结构式如下：
特异性结合糖蛋白的是化合物上的硼酸基团。在特定波长的激发下，该硼酸盐化合物中的荧光基团被激发产生荧光信号。当该硼酸盐化合物结合糖蛋白后，在特定波长激发下，其产生的荧光因能量传导被淬灭而不再产生荧光。这种淬灭效应随着体系中糖蛋白含量的升高而增强。利用此原理，可设计检测体系，通过监测荧光强度的变化，定量检测人体糖蛋白的含量。然而，该硼酸盐化合物存在如下问题：1、其激发光和吸收光波长较短，容易相互干扰，影响检测精度。2、该硼酸盐的荧光强度较弱，检测灵敏度和准确度有待进一步提高。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于糖蛋白检测的新型硼酸盐及其制备方法，以解决背景技术存在的上述缺陷。
本发明是通过如下的技术方案实现的：
一种用于糖蛋白检测的硼酸盐，具体为6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素苯硼酸盐，其化学结构式如下：
该硼酸盐化合物的物性参数如下：
1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ3.73(s,6H),6.01(s,2H),7.07(m,3H),7.27(s,1H)7.40(d,J＝7.8Hz,1H),8.17(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),8.60(d,J＝1.4Hz,1H),10.20(br,1H)。
分子量:624。
本发明还公开了上述用于糖蛋白检测的硼酸盐的制备方法，包括如下步骤：将2-氯-4-甲氧基-1,3-苯二酚和偏苯三酸酐反应制得4,5-二氯-2,7-二甲氧基-6-羧酸-荧光素，然后将所述4,5-二氯-2,7-二甲氧基-6-羧酸-荧光素与间氨基苯硼酸反应制得6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素苯硼酸盐。
其中，2-氯-4-甲氧基-1,3-苯二酚通过2-氯代香兰素和双氧水反应制得。
具体的，所述2-氯-4-甲氧基-1,3-苯二酚的制备方法，包括如下步骤：
将2-氯代香兰素溶于二氯甲烷中,冷却到-5℃～0℃，加入二氧化硒和双氧水，在15℃-20℃下充分反应，然后将反应液倒入亚硫酸氢钠水溶液中，分液并干燥，将有机相浓缩至干并溶于盐酸甲醇溶液中，再浓缩至干，经重结晶后得到类白色固体2-氯-4-甲氧基-1,3苯二酚。
优选的，2-氯代香兰素和双氧水的摩尔比为1：3。二氧化硒是作为反应的催化剂，其用量可根据反应效率和催化效果等进行调节，最好是2-氯代香兰素摩尔用量的5-10％。二氯甲烷作为溶剂，亚硫酸氢钠水溶液的作用是在反应结束后将未反应的双氧水除去，盐酸甲醇溶液的作用是使生成的酚游离出来，这些助剂/溶剂的用量可以根据实际需要进行调节。
作为优选的技术方案，4,5-二氯-2,7-二甲氧基-6-羧酸-荧光素的制备方法，包括如下步骤：将2-氯-4-甲氧基-1,3苯二酚和偏苯三酸酐溶于甲磺酸中，然后加入无水四氯化锡并加热到80℃-90℃，充分反应后冷却到室温，将反应液倒入到冰水中，收集析出的固体，然后用柱层析纯化分离，分别得到4,5-二氯-2,7-二甲氧基-5-羧酸-荧光素和4,5-二氯-2,7-二甲氧基-6-羧酸-荧光素。
2-氯-4-甲氧基-1,3苯二酚和偏苯三酸酐的摩尔比为2：1。无水四氯化锡是作为催化剂，2-氯-4-甲氧基-1,3苯二酚和无水四氯化锡的摩尔比为2：1。
所述柱层析纯化所用的洗脱剂为三乙胺、甲醇和二氯甲烷。优选的，其摩尔用量如下三乙胺：甲醇：二氯甲烷为1:5:14。
作为优选的技术方案，所述6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素苯硼酸盐的制备方法，包括如下步骤：将4,5-二氯-2,7-二甲氧基-6-羧酸-荧光素和间氨基苯硼酸溶于D,D-二甲基甲酰胺中并冷却到-5℃～0℃,加入脱水剂充分反应，然后将反应液纯化后得到6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素苯硼酸盐。
4,5-二氯-2,7-二甲氧基-6-羧酸-荧光素和间氨基苯硼酸的摩尔比为1：1。
优选的，所述脱水剂为二环己基碳二亚胺(DCC)。
优选的，所述纯化采用制备型高效液相色谱(HPLC)进行。
本发明制备得到的硼酸盐能特异性结合糖化蛋白，尤其是糖化血红蛋白，可应用于人体糖蛋白的检测。与现有技术使用的硼酸盐相比，具有如下有益效果：
1、本发明硼酸盐结构稳定；
2、本发明硼酸盐的激发光和吸收光波长相互间没有干扰，检测精度高；
3、本发明硼酸盐的荧光强度高，大大提高了检测灵敏度和准确性。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行阐述，但并不限制本发明。
一、2-氯-4-甲氧基-1,3苯二酚的合成。可用如下反应式表示：
具体制备步骤如下：将2-氯代香兰素(1)(37.32g,0.2mol)溶在650ml二氯甲烷中,并冷却到0度。加入二氧化硒(1.78g,0.016mol),30％双氧水(61ml,0.6mol)。然后在20度搅拌48小时，将反应液倒入200mL 10％的亚硫酸氢钠水溶液中，分液，将分液并用无水硫酸钠干燥。有机相浓缩至干并溶在10％HCl甲醇溶液(400ml)在室温下搅拌1小时。将反应浓缩至干并用石油醚比乙酸乙酯1:5(200ml)重结晶得到类白色固体2-氯-4-甲氧基-1,3苯二酚(2)。(产量29.33g,收率84％)。
二、4,5-二氯-2,7-二甲氧基-5(6)羧酸-荧光素的合成。可用如下反应式表示：
具体制备步骤如下：将2-氯-4-甲氧基-1,3苯二酚(2)(17.45g,0.1mol)和偏苯三酸酐(9.6g,0.05mol)溶在甲磺酸(50ml)。然后加入无水四氯化锡(5.85ml,0.05mol)并加热到80度搅拌6小时然后冷却到室温。将反应液倒入到300ml冰水中，收集析出的固体。这个固体混合物用柱层析纯化(洗脱剂三乙胺：甲醇：二氯甲烷＝1:5:14)得到4,5-二氯-2,7-二甲氧基-5-羧酸-荧光素(3)(8.5g)和4,5-二氯-2,7-二甲氧基-6-羧酸-荧光素(4)(6.5g)。总收率58.8％。
三、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素苯硼酸盐的合成。可用如下反应式表示：
具体制备步骤如下：将4,5-二氯-2,7-二甲氧基-6-羧酸-荧光素3(4)(5.05g,10mmol)和间氨基苯硼酸(5)(1.37g,10mmol)溶在50ml D,D-二甲基甲酰胺中并冷却到0度,将DCC(2.3g,11mmol)溶在10ml D,D-二甲基甲酰胺中滴加入反应液中保持稳定在0-5度，然后自然升温到室温搅拌20小时，然后将反应液用制备型HPLC纯化并冻干得到6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素苯硼酸盐(2.5g,收率41％,纯度98.5％)。其核磁共振测定结果如下：1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ3.73(s,6H),6.01(s,2H),7.07(m,3H),7.27(s,1H)7.40(d,J＝7.8Hz,1H),8.17(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),8.60(d,J＝1.4Hz,1H),10.20(br,1H)。MS Calcd.:624；MS Found:625(M+1)+。
经测定，本发明硼酸盐的最大激发光波长为531nm，最大吸收光波长为563nm，相互间不会产生干扰。在相同的检测条件下，其荧光强度是欧洲专利EP0772779B1公开的硼酸盐荧光强度的10倍。因此将本发明硼酸盐应用于糖蛋白检测，可显著提高检测灵敏度和准确性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。