本发明属于植物病害生物防治技术领域，更具体涉及一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3，同时还涉及一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3的制备方法，再涉及一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3的用途。
背景技术：
由于果蔬产品的生产地都远离城市，而且成熟期也相对集中，需要有一定的贮藏和运输周期，在此期间大量的采后损失，特别是果蔬的腐烂。据报导，发达国家有10％-30％的新鲜果品损失于采后的腐烂，在缺乏贮运冷藏设备的发展中国家，其腐损率高达40％-50％。目前对这类病害的防治仍然以化学药剂防治为主，这不仅对人、畜以及生态环境产生严重危害，还会增加农产品中有毒化学物质的残留量，同时也容易诱致植物对病原菌抗药性的产生。近年来，已经有研究者采用芽孢杆菌代替部分传统的化学农药，为果蔬采后病害防治提供新的研究思路和方法【田世平和范青，控制果蔬采后病害的生物学技术，植物学通报，2000，17 (3)：211-217】。
梨果实采收后在储藏期间经常会发生腐烂，采后储藏期的腐烂常由轮纹病菌和炭疽病菌侵染所致。目前，已有研究采用芽孢杆菌来控制储藏期的苹果腐烂，包括采用地衣芽孢杆菌防治由苹果轮纹病菌和炭疽病菌引起的苹果腐烂病【纪兆林等，地衣芽孢杆菌对苹果轮纹病菌和炭疽病菌的抑制及其对贮藏期苹果轮纹病的防治作用，果树学报，2008，25 (2)：20 9～2 14】，处理苹果果实防病率达到 33.0%；采用解淀粉芽胞杆菌NCPSJ7对采后苹果轮纹病进行防治【黄玲玲等，采用解淀粉芽胞杆菌NCPSJ7对采后苹果轮纹病的生物防治作用，中国食物与营养2015，21(2)：20-24】；采用枯草芽孢杆菌B-903控制采后苹果轮纹病，病菌侵入前接种B-903 菌液10倍液、20倍液处理效果较好，第7d的抑制效果达64.4-68.2%；病菌侵入发病后用B-903处理的抑制效果为13.5-25.8%【赵白鸽等，枯草芽孢杆菌 B-903对苹果轮纹菌的抑菌作用及其对病害的控制效果，植物病理学报，1996，27（3）213-214】。以上研究主要采用各种芽孢杆菌控制采后苹果轮纹病和炭疽病，但各个菌株效果都不够理想，且工作浓度都偏低（原液或20倍稍加稀释），不能满足生产上实际应用需要。也有人筛选和利用枯草芽孢杆菌防治采后梨轮纹病，从梨样品中分离到了21株枯草芽孢杆菌，可以抑制接种梨轮纹菌后梨果实的腐烂，抑制病斑扩展效率为40％以上【丁芳兵，筛选和利用枯草芽孢杆菌防治梨轮纹病，江苏农业学报，2009，25 (5 )：1002-1006】，还远不能满足生产上实际应用需要。
技术实现要素：
本发明的目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) DYr3.3，该菌株具有广谱抗真菌活性，对梨树的主要病原真菌，包括梨轮纹病菌（Botryosphaeria berengeriana）、梨炭疽菌（包括Colletotrichumfructicola、Colletotrichumgloeosporioides）、梨腐烂病菌（Valsamalivar. pyri）、梨胴枯病菌（Phomopsis fukushii）等）均有显著的抑菌活性。此外，还对其它常见园艺作物病原真菌，如山茶刺盘孢菌（Colletotrichumcamelliae）、拟茎点霉菌（Phomopsissp.）、茶拟盘多毛孢（Pestalotiopsis_theae）、柑橘青霉菌（Penicilliumitalicum）均具有良好的拮抗活性。
本发明的另一个目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌的制备方法，方法易行，操作简便，经过液体发酵后，获得了便于溶于水中使用和耐储藏的液体制剂，测定孢子浓度为4.41×107cfu/mL
本发明还有一个目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) DYr3.3在制备治疗或预防梨果实腐烂病药物中的应用， 该菌株的发酵产品对梨果实的腐烂具有良好的防病效果，显著抑制梨果实腐烂，防效可以达到100％。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
本研究发现了一株枯草芽孢杆菌菌株DYr3.3，该菌株可以强烈抑制梨果实因轮纹菌和炭疽菌引起的腐烂，效果可以达到100%，具有显著的实际应用潜力。
一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌的制备方法，其步骤是：
（1）在湖北省黄石市大冶玫瑰地采集紫枝玫瑰根，将根切成长约0.5 cm大小的组织，经过70%（体积比）酒精消毒1 min，经无菌水冲洗2-3次后，放置于PDA培养基上24－26℃暗培养，培养34－38h后，将长出来的细菌菌落转移至新的PDA培养基上划线分离纯化单菌落；
所述的PDA培养基的制备方法为：将200 g马铃薯、20 g蔗糖、15 g琼脂粉溶于1000 mL蒸馏水，调pH值至6.8－7.2左右；
（2）分离纯化后，获得一种来源于紫枝玫瑰根部的拮抗细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株DYr3.3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，菌株DYr3.3于2018 年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2018024，DYr3.3在平板对峙实验中对梨轮纹菌（见图1）和多种致病菌（见图3）具有很强的拮抗能力，对梨果实腐烂具有良好防效；
一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3在制备治疗或预防梨果实腐烂病药物中的应用，其步骤是：
A、无菌环境下挑取DYr3.3菌株单菌落，接种于装有装有90mL 最适培养液A（3.0％（质量体积比）葡萄糖，0.5％（质量体积比）酵母提取粉，0.3％（质量体积比）氯化钠，0.1％（质量体积比）硫酸镁，调节pH 值6.0～6.5）的250mL 三角瓶中，28°C、150r/min振荡培养24 h，获得种子培养菌液。
B、准备500ml三角瓶10个，每瓶装200 mL培养液A，每瓶按照1:100的比例加入步骤A得到的种子培养菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中， 28 °C下150 r/min振荡培养48 h，获得DYr3.3发酵液，浓度为4.89×106cfu/mL。
C、取步骤B得到的DYr3.3菌株发酵液，用清水稀释100倍，将梨果实浸泡30 s后捞出，晾干，低温（4°C）或室温（20－25°C，以下相同）储藏即可。
菌株DYr3.3经过液体发酵获得的DYr3.3菌液可以阻止因梨轮纹病和炭疽病危害造成的梨果实腐烂，可以应用于梨果实腐烂病的防治。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
（1）梨果实采收后在储藏期间经常会发生腐烂，采后储藏期的腐烂常由轮纹病菌和炭疽病菌侵染所致。目前尚无有效预防梨果实腐烂的芽孢杆菌类生防制剂，枯草芽孢杆菌DYr3.3具有应用于防治梨果实腐烂的显著效果，具有应用于果蔬保鲜的优点和效果。
（2）商品化开发的枯草芽孢杆菌菌株主要用于大田作物田间病害防治，而非果实产后病害防治，如江苏农业科学院植物保护研究所发现的枯草芽孢杆菌B-916菌株已进行农药登记，应用于水稻纹枯病田间防治；南京农业大学生防菌B3(商品名麦丰宁)应用于小麦纹枯病田间防治。因此，菌株DYr3.3具有不同于其它已经商品化枯草芽孢杆菌菌株的应用方向。
（3）前期已经有人筛选了应用于防治轮纹病菌的枯草芽孢杆菌。例如，有研究人员从梨样品分离获得了21个枯草芽孢杆菌菌株，可以抑制病斑扩展，效率约为40％【详见：丁芳兵，筛选和利用枯草芽孢杆菌防治梨轮纹病，江苏农业学报，2009，25 (5 )：1002-1006】；生防菌11对梨轮纹病的防效为23．83％【详见：刘邮洲等，碳酸氢钠（NaHCO3）对生防菌防治采后梨轮纹病的影响，果树学报，2010,27 ( 5) : 757 – 763】；2株枯草芽孢杆菌Sf-19和Sf-28原液对梨轮纹病菌的室内抑制效率为71．97％和64．54％【详见：张丽丽等，2株枯草芽孢杆菌对梨轮纹病菌的室内抑制作用研究,果树学报,2010，27（5）：823-827】。也有类似研究是采用枯草芽孢杆菌控制采后苹果轮纹病，但结果显示该菌株防治效果不佳，仅在10倍液、20倍液处理下第7d的抑制效果达64.4-68.2【赵白鸽等，枯草芽孢杆菌 B-903对苹果轮纹菌的抑菌作用及其对病害的控制效果，植物病理学报，1996，27（3）213-214】。综上所述，前期分离的枯草芽孢杆菌在防治采后梨轮纹病的防治实验中效果并不明显，因此，该 DYr3.3菌株比前期获得的枯草芽孢杆菌菌株具有更好的防治梨果实腐烂作用。
（4）也有研究采用其它芽孢杆菌来控制储藏期的苹果腐烂，包括采用地衣芽孢杆菌和解淀粉芽胞杆菌防治由苹果轮纹病菌和炭疽病菌引起的苹果腐烂病，但所获得菌株防病效果并不显著【见：纪兆林等，地衣芽孢杆菌对苹果轮纹病菌和炭疽病菌的抑制及其对贮藏期苹果轮纹病的防治作用，果树学报，2008，25 (2 )：20 9～2 14；黄玲玲等，采用解淀粉芽胞杆菌NCPSJ7对采后苹果轮纹病的生物防治作用，中国食物与营养2015，21(2)：20-24】。因此，枯草芽孢杆菌菌株DYr3.3菌株比前期获得的其它种类芽孢杆菌菌株具有更好的防治梨果实腐烂作用。
附图说明
图1为一种枯草芽孢杆菌菌株DYr3.3的形态及抑制梨轮纹菌的作用效果。
其中，PDA培养基中间为梨轮纹菌（Botryosphaeria berengeriana）菌株，显示生长被周围菌株抑制； PDA培养基周围为多个菌株DYr3.3菌落。
图2为一种在600nm波长下枯草芽孢杆菌菌株DYr3.3不同吸光值与浓度间的线性关系图。
该图是挑取菌株DYr3.3单菌落放入培养基A（3.0％葡萄糖，0.5％酵母提取粉，0.3％氯化钠，0.1％硫酸镁，调节pH 值6.0～6.5）中，28℃培养48 h后，按照1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100 倍进行稀释，测定600 nm波长下的吸光值。取 50 μL 稀释至 10−5 、10−6 倍，接种在最适固体培养基上进行涂板，密封后放置于 28 °C 的恒温培养箱进行培养，定期观察直至出现清晰可数的菌落再进行测定。测定OD600吸光值和对应菌体生物量，显示吸光值（x）和菌体量(y)呈正相关，线性方程为y=45,607,035x-831,951（R2=0.9884）。
图3为一种在PDA培养基上枯草芽孢杆菌株DYr3.3对12个真菌菌株的对峙抑菌效果图。
平板中央为划线的DYr3.3菌液，两边为接种的真菌菌丝块。CK-为不加菌株DYr3.3，仅加真菌菌丝块的对照。所用真菌和菌株标注在平板上方。
图4为一种在PDA培养基上多粘类芽孢杆菌菌株DYr3.3对12个真菌菌株的对峙抑菌宽度柱状图。纵坐标为抑菌宽度，横坐标为测定真菌及菌株。显著性差异分析采用SPSS Statistics 21.0 (WinWrap Basic; http://www.winwrap.com)进行差异显著性分析（Duncan’s test，P = 0.05）。
图5为一种DYr3.3抑制梨果实腐烂代表效果图。
A，左图“CK+”为接种梨轮纹菌菌丝块（上）和梨炭疽菌菌丝块（下）果实发病图片；右图“DYr3.3”为浸泡DYr3.3发酵液后，接种梨轮纹菌菌丝块（上）和梨炭疽菌菌丝块（下）梨果实腐烂没有发生腐烂图片；B，单独接种梨轮纹菌菌丝块和梨炭疽菌菌丝块及浸泡DYr3.3发酵液后接种这两种菌后病斑长度柱状图。
具体实施方式
实施例1：
一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌的制备方法，其步骤是：
（1）在湖北省黄石市大冶玫瑰地采集紫枝玫瑰根，将根切成长约0.5 cm大小的组织，经过70%（体积比）酒精消毒1 min，经无菌水冲洗2-3次后，放置于PDA培养基上25℃暗培养，培养36h后，将长出来的细菌菌落转移至新的PDA培养基上划线分离纯化单菌落；
所述的PDA培养基的制备方法为：将200 g马铃薯、20 g蔗糖、15 g琼脂粉溶于1000 mL蒸馏水，调pH值至7.0左右；
（2）分离纯化后，获得一株来源于紫枝玫瑰根部的拮抗细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株DYr3.3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，菌株DYr3.3于2018 年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2018024，DYr3.3在平板对峙实验中对梨轮纹菌（见图1）和多种致病菌（见图3）具有很强的拮抗能力，对梨果实腐烂具有良好防效；
拮抗菌DYr3.3的分子鉴定:
提取拮抗细菌DYr3.3的基因组DNA【详见：王瑞霞等,马铃薯环腐病生防菌株P1的鉴定、防病效果及促生作用研究，植物病理学报，2010，40（1）：66 - 73】，以提取的DNA为模版，采用BSF （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和BSR（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）引物对16S rDNA进行扩增，预期大小为1500bp。
PCR反应体系：10×PCR buffer（含 Mg2＋）2.5 µL，10mmol/L dNTPs 0.5 µL，10 µmol 同源和互补引物各0.5 µL，Taq DNA 聚合酶0.2 µL，DNA 模板1 µL，去离子水19.8µL。
PCR反应条件为：95℃预变性4min，然后94℃变性30s， 55℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃再延伸5min，16℃终止。
PCR产物都经1%琼脂糖凝胶电泳分析，将目标片段纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将获得的序列与NCBI 数据库中的序列采用BLASTn进行相似性分析，结果表明：菌株DYr3.3的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）OPP3 1的16S rDNA序列（序列登陆号：JQ308571.1）同源率为99%（coverage 98%, E value 0.0, identity 99%）。
微生物鉴定：
将菌株送华中农业大学农业微生物学国家重点实验室进行Biolog微生物鉴定，进行71种碳源利用率和23种化学敏感性测定。主要步骤如下：将菌株DYr3.3在BUG平板上进行四区划线纯化培养，33℃黑暗过夜培养后，挑单菌落于接种液IF-B中并混匀，然后接种到Biolog 96孔鉴定板中，每孔接种100 μL，密封鉴定板置于33℃进行暗培养16-24小时，之后进行读数。结果显示菌株DYr3.3与Bacillus atrophaeus/subtilis即萎缩芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌相似性最高( PROB 0.575；SIM 0.575； DIST 6.258； Organism Type GP-Rod-SB；Species Bacillus atrophaeus/subtilis)。综合分子鉴定和Biolog鉴定结果，将DYr3.3确定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
拮抗菌DYr3.3的菌落和形态特征
在LB 平板上，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) DYr3.3菌株的菌落不规则，边缘常呈不规则波状突起，扁平，乳白色，不透明（见图1）。
拮抗菌DYr3.3的培养：
DYr3.3 菌株的培养条件为：菌株活化采用PDA培养基，即200 g马铃薯、20 g蔗糖、15 g琼脂粉溶于1000 mL蒸馏水，pH值7.0左右。取适量菌液在分PDA培养基上进行划线培养。接种后放置于28 °C恒温培养箱暗培养，至出现菌落。
采用培养基A用于菌株DYr3.3的发酵培养和孢子数目的测定，培养基A的具体配方为：3.0％葡萄糖（质量体积比），0.5％酵母提取粉（质量体积比），0.3％氯化钠（质量体积比），0.1％硫酸镁（质量体积比），调节pH 至6.0～6.5；其中固体培养基加琼脂7～8g（每500mL培养基），培养基在121℃高压蒸汽灭菌20 min。
将培养获得的发酵液，加培养基A稀释到不同倍数，获得稀释倍数为1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100倍的样品菌悬液，并以培养基A作为空白对照。使用UITROSPEC核酸蛋白检测仪在波长600 nm下测量不同稀释倍数样品 OD600 值。为了提高实验数据的精确度，制备3组平行样。
另制备稀释到 10−3 、10−4 、10−5 、10−6 倍的样品菌悬液，用于孢子数目测定。取 50 μL 稀释至 10−5 、10−6 倍的DYr3.3样品菌悬液及稀释至 10−4 、10−5 倍的菌悬液分别接种在最适固体培养基上进行涂板，密封后放置于 28 °C 的恒温培养箱进行培养，定期观察直至出现清晰可数的菌落再进行测定。为提高试验精确度，每种稀释倍数样品做5 个重复。测定OD600吸光值和菌体生物量线性方程为y=45,607,035x-831,951（R2=0.9884）（图2）。
拮抗菌的拮抗实验
采用平板对峙法筛评价菌株DYr3.3对真菌的拮抗活性：在PDA培养基上，取10 μL摇培的菌液涂划于培养皿的正中间，在离细菌线的4 cm处接直径为5 mm的菌丝块，设置无抑制菌处理为对照，每个处理重复3培养皿，于25℃暗培养，当对照组刚长满整培养皿时，测量各处理抑菌圈大小，根据有无抑菌带及抑菌带的大小判断其拮抗效果。
测试拮抗菌株包括梨轮纹病菌（Botryosphaeria berengeriana）、果生炭疽菌（Colletotrichumfructicola）、梨腐烂病菌（Valsamali var. pyri）、梨胴枯病菌（Phomopsis fukushii）、山茶刺盘孢菌（Colletotrichumcamelliae）、茶拟盘多毛孢（Pestalotiopsis_theae）、拟茎点霉菌（Phomopsissp.）、毛霉（Mucorracemosus）意大利青霉菌（Penicilliumitalicum）、和黑根霉（Rhizopusnigricans），这些菌均由本实验室前期分离所得。结果显示，DYr3.3除了对腐生菌毛霉和黑根霉无明显抑菌作用外，对其它致病真菌均有强的抑菌作用，抑菌范围为5.3-11.5 mm，且对不同的致病菌的抑菌效果具有显著性差异。
实施例2
一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在制备或防治梨果实腐烂病药物中的应用，其步骤是：
A、无菌环境下挑取DYr3.3菌株单菌落，接种于装有装有90mL 最适培养液A（3.0％（质量体积比）葡萄糖，0.5％（质量体积比）酵母提取粉，0.3％（质量体积比）氯化钠，0.1％（质量体积比）硫酸镁，调节pH 值6.0～6.5）的250mL 三角瓶中，28°C、150r/min振荡培养24 h，获得种子培养菌液。
B、准备500mL三角瓶10个，每瓶装200 mL发酵液，每瓶按照1:100（体积比）的比例加入种子培养菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中， 28 °C下150 r/min振荡培养48 h，获得DYr3.3发酵液，浓度为4.89×106cfu/mL。
取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) DYr3.3菌株发酵液，用清水稀释100倍，将梨果实浸泡30 s后捞出，晾干，低温（4-8℃）或常温（20－25℃）储藏即可。
实施例3：
拮抗菌的防治梨果实腐烂实验
将枯草芽孢杆菌菌株DYr3.3稀释100倍液，获得浓度为4.89×106的菌悬液，再将从超市购买完全成熟的梨果实（河北皇冠梨，Pyrus bretschneideriRehd. var. Huangguanli）分别浸泡在配制好的菌悬液中约30 s，使其表面充分均匀地沾上细菌，之后拿出晾干。每个处理组6个重复，在果实腰部等距离接种活化的梨轮纹病菌菌饼（直径5 mm），再将用无菌水浸泡过的湿润的棉花片覆盖在接种处。另取2只未经菌悬液浸泡的梨作为CK+对照组。把处理过的梨分别置于铺有一层湿润纱布和保鲜膜的塑料托盘中，随时保持盘内有较高的相对湿度，最后用保鲜膜密封塑料盘，置于30 ℃环境下培养。待阳性对照发病严重后记载结果。
结果显示，采用DYr3.3发酵液喷施果实后接种梨轮纹菌（Botryosphaeria berengeriana）菌丝块进行防病实验；同时喷施无菌水后接种菌丝块作为对照。结果显示，接种2天后，喷施清水后接种菌丝块的对照组均开始发病菌，病斑随后逐渐扩展，至5天，发病果实基本全部腐烂，而DYr3.3发酵液处理果实无发病，重复三次结果相似。
同时，将采用DYr3.3发酵液喷施果实后接种胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）梨轮纹菌（Botryosphaeria berengeriana）菌丝块进行防病实验，同时喷施无菌水接种菌丝块作为对照，6个重复，待对照组果实完全腐烂后统计结果。结果显示，接种7天后，喷施清水后接种菌丝块对照组发病严重，发病果实基本全部腐烂，而菌株DYr3.3处理果实无发病（见图5）。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3及制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccaaggtct gggagtctat aatgcagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgata 60
ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120
ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtc tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg 180
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aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac 840
gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca 1020
ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140
caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200
cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca 1260
aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1320
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa cctttatggt agccagccgc 1440
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