本发明涉及一种孕甾烷糖苷化合物及其在制备免疫抑制药物、抗炎药物中的应用。
背景技术：
免疫抑制剂在临床为自身免疫病和器官移植后的排斥反应提供了有效的治疗药物，通常用来抑制器官移植后出现的排异反应，治疗骨髓移植后出现的移植物抗宿主病，或治疗类风湿性关节炎、克隆氏症等自身免疫性疾病。抗炎药是用于治疗组织受到损伤后所发生的反应炎症的药物；甾体类药物是临床常用的免疫抑制剂和抗炎药物，如泼尼松、地塞米松、甲泼尼龙等。它能有效抑制炎症因子，减少各种免疫细胞。
现有的如糖皮质激素之类的甾体抗炎药物和免疫抑制剂长期用药普遍存在产生耐药性、毒副作用大、使用不方便等缺点，因此一般仅在重大疾病的治疗中使用。中药作为一种天然产物，具有与人组织相容性质好、副作用小等优点，在免疫抑制剂和抗炎制剂的研究中越来越受到人们的重视。因而，从天然产物中寻找具有免疫抑制和抗炎作用的化合物，对于开发高效低毒的新型免疫抑制剂和抗炎药物具有应用价值。
思茅藤属(epigynum)是夹竹桃科思茅藤族的一个属，根据我们前期的研究结果，思茅藤属植物中富含雄甾烷、孕甾烷及其糖苷类物质。本发明提供的孕甾烷糖苷化合物及其作为免疫抑制药物和抗炎药物目前尚未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种结构式如式ⅰ所示的孕甾烷糖苷类化合物：
r1,r2均选自糖基。
上述糖基是指2,3-甲氧基-6-去氧-β-d-艾杜糖和2,6-二去氧-β-d-吡喃阿拉伯己糖；分别位于r1和r2位置。
本发明另一目的是提供结构式如式ⅱ所示的孕甾烷糖苷类化合物：
式ⅱ：17α-羟基-孕甾-5(6)-烯-3β-o-2,3-甲氧基-6-去氧-β-d-艾杜糖-20α-o-2,6-二去氧-β-d-吡喃阿拉伯己糖苷，通俗名epigycosideb。
本发明的另一目的是将上述孕甾烷糖苷化合物应用在制备免疫抑制药物中。
具体免疫抑制药物应用在制备自身免疫性疾病的治疗药物中，或应用在制备器官移植抗排斥反应的治疗药物中。
本发明另一目的是将上述孕甾烷糖苷类化合物应用在制备抗炎药物中。
本发明所述应用中还可以药物上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。
本发明所述应用除制成胶囊外，还可以制成丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。
本发明中用健康的balb/c小鼠来制备脾细胞用于试验；脾细胞制备完成后，通过cona或者lps进行诱导，同时在试验组加入不同浓度供试化合物，以对应浓度的地塞米松(dexamethasone，简称dxms)作为阳性对照，培养72h后，通过cellcountingkit-8(cck-8)试剂法分别测定试验组、阳性对照组、诱导对照组和未诱导对照组的吸光值，从而评价化合物调节t细胞或者b细胞增殖的能力；实验结果表明本发明中孕甾烷糖苷类化合物epigycosideb对cona或lps刺激的balb/c小鼠t脾淋巴细胞或b淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用，与不加该化合物的对照组相比有显著性差异(p<0.05)。
本发明中使用lps诱导的小鼠腹腔巨噬细胞(raw264.7)作为炎症模型，raw264.7细胞生长状态稳定后，在试验组加入不同浓度的供试化合物，以对应浓度的地塞米松为阳性对照，继续孵育2h加入lps诱导raw264.7细胞发生炎症反应，继续培养24h，收集培养基上清进行使用酶联免疫吸附测定(elisa)法检测肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素1β(il-1β)以及前列腺素e2(pge2)三种炎症因子的表达水平；以此评价化合物的体外抗炎活性；实验结果表明本发明中孕甾烷糖苷类化合物epigycosideb对lps诱导的raw264.7细胞分泌的tnf-α、il-1β以及pge2三种炎症因子的表达水平都具有明显的抑制作用，与不加该化合物的对照组具有显著性差异(p<0.05)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1：epigycosideb的制备
将缅甸思茅藤(epigynumcochinchinensis)枝叶分捡，所得叶5kg于干燥通风处自然晾干后，使用打粉机打成碎片；缅甸思茅藤叶碎片浸没于10l体积浓度75％甲醇溶液中浸渍提取，每次12小时，连续浸提三次；收集合并浸提液，使用旋转蒸发仪减压浓缩除去液体，得到浸膏500g；浸膏加2l水溶解后置于分液漏斗，再加等体积乙酸乙酯进行反复萃取；多次萃取至乙酸乙酯层几近无色，收集合并乙酸乙酯层蒸干后获得粗提物浸膏120g；使用中压色谱分离系统将粗提物过mci柱，经体积浓度90％甲醇水冲洗5个柱体积获得不含植物色素等杂质的样品，100％甲醇冲洗所得之色素等杂质弃掉；最终获得后续可分离总样品60g。
经乙酸乙酯萃取并除去色素后获得总样品60g，100gc18填料拌样后，使用中压色谱进行分离，依次用体积浓度20％甲醇水、40％甲醇水、60％甲醇水、80％甲醇水和100％甲醇水梯度冲洗，每个梯度冲洗10l流动相。每个浓度冲洗所得样品单独保存，分别标记为fr.a(10g)、fr.b(10g)、fr.c(14g)、fr.d(12g)、fr.e(12g)。
fr.d(12g)部分使用c18中压柱以甲醇水(40:60-80:20)每10％比例变换进行梯度洗脱，洗脱液300ml每份进行收集，得到frd1、d2、d3、d4、d5等5个部分。
fr.d1(2.1g)部分进行硅胶柱层析分离，以氯仿：丙酮(10:1-2:1)体系梯度冲柱，每150ml洗脱液分别收集，结合tlc检测合并相同组分的收集液，tlc检测分析后，最终保留3个部分，fr.d1-1，fr.d1-2，fr.d1-3；其中fr.d1-1经过凝胶柱使用甲醇进行洗脱纯化处理，最终获得单体化合物epigycosideb(3.5mg)；
经鉴定本发明孕甾烷糖苷化合物epigycosideb为新化合物；鉴定结果如下：
式ⅱ化合物epigycosideb为白色不定型粉末，易溶于氯仿、甲醇等溶剂。[α]
1hnmr(methanol-d4,600mz)和13cnmr(methanol-d4,150mz)见表1；以上数据结合2dnmr分析证实了该化合物的化学结构式为式ⅱ中所示，为一个新的天然有机化合物，命名为epigycosideb。
表1：epigycosideb1hnmr和13cnmr数据
aov:overlap。
实施例2：免疫抑制检测试验
(1)脾淋巴细胞悬液的制备
取18～22g的健康babl/c小鼠摘除眼球放血后脱颈处死，置于体积浓度75％酒精中浸泡消毒3-5分钟，取出置于无菌托盘中，腹左侧朝上，在安全柜中，用消毒过的镊子夹起腹中部皮毛，自下端始作一切口，用另外一套器械剪开腹壁各层，用第三套器械将脾取出，去除脂肪和结缔组织，放入pbs(磷酸盐缓冲液)中，洗去浮血。然后将脾组织移至盛有rpmi1640不完全培养液的平皿中，用剪刀剪成小块，用无菌注射器芯在200目不锈钢筛网中将脾轻轻研碎，用pbs少量多次冲洗，将悬液用移液器转移至15ml离心管中；1000r/min转速离心5min；弃上清液，加入3ml红细胞裂解液(tris-nh4cl)混匀，静置2min后加入9mlpbs终止反应，离心(1000rpm,5min)，去上清，沉淀用5mlpbs洗涤两次，同样条件下离心；最后沉淀用5ml含10％胎牛血清的rpmi1640完全培养液悬浮；以0.8％台盼兰活细胞拒染法计数，活细胞数不少于95％，加rpmi1640完全培养液稀释，调整细胞浓度至1×106个/ml左右。
(2)供试液的制备
精密称取单体化合物及地塞米松各2mg，加入dmso溶解，用rpmi-1640培养基稀释至所需浓度；精密称取cona和lps各2mg并分别使用pbs和dmso溶解，用rpmi1640培养基稀释至所需浓度。控制各添加物溶解所用dmso终浓度不超过0.1％。
(3)实验分组
阴性对照组：100μl脾细胞悬液+10μlcona溶液+10μlrpmi-1640培养液
阳性对照组：100μl脾细胞悬液+10μlcona溶液+10μl地塞米松溶液
受试样品组：100ul脾细胞悬液+10μlcona溶液+10μl受试样品
正常对照组：100ul脾细胞悬液+20μlrpmi-1640培养液
空白对照组：120μlrpmi-1640培养液；
96孔板中，每孔加入淋巴细胞悬液(1×106个/ml)100μl，cona10μl(终浓度为10μg/ml)，不同浓度试药化合物稀释液10μl(终浓度分别为12.5、25、50μg/ml)，地塞米松也做三个对应的浓度组，每个浓度组设4个平行。
(4)培养：置于37℃，5％co2培养箱内培养72小时。
(5)cck-8法测定细胞od值
培养72小时后，每孔中加入10μl的cck-8试剂(碧云天)，置于37℃，5％co2培养箱内继续培养4小时后，在450nm处测定每孔的吸光值以计算细胞增殖情况，并按下式计算刺激指数(si)：
si(刺激指数)＝加有丝分裂原培养物的od值/不加有丝分裂原培养物的od值。
(6)数据处理
实验数据od值采用“平均数±标准差”来表示，数理统计及方差分析工作采用origin软件完成。
(7)实验结果
表2：式ⅱ化合物干预下balb/c小鼠脾t淋巴细胞增殖刺激指数
式ⅱ中化合物epigycosideb在作用浓度为12.5、25、50μm时，试验组刺激指数分别为2.82、2.06、1.56；显著性分析表明，各浓度作用效果与阴性对照组比较差异性都极其显著(p<0.01)。
阳性对照地塞米松(dxm)在浓度为12.5、25、50μm时，试验组刺激指数分别为1.43、1.24、1.14；各浓度组作用效果与阴性对照组比较都具有及其显著差异(p<0.01)。
实验结果表明，本发明中所述化合物epigycosideb在12.5μm时具有抑制t淋巴细胞增殖的活性，在50μm范围内，随浓度增高其抑制效果增强。
表3：式ⅱ化合物干预下balb/c小鼠脾b淋巴细胞增殖的刺激指数
epigycosideb在作用浓度为12.5、25、50μm时，试验组刺激指数分别为6.02、5.19、2.80；显著性分析表明，在12.5μm浓度下作用效果与阴性对照组比较具有显著性差异(p<0.05)，随浓度增高，刺激指数降低，对b淋巴细胞增殖抑制作用增强。浓度在25μm和50μm时与阴性对照组相比差异极其显著(p<0.01)。
阳性对照地塞米松(dxms)在浓度为12.5、25、50μm时，试验组刺激指数分别为4.11、3.46、1.89；各浓度组作用效果与阴性对照组比较都具有极其显著差异(p<0.01)。
实验结果表明，化合物epigycosideb在12.5μm时具有抑制b淋巴细胞增殖的活性，在50μm范围内，随浓度增高，刺激指数降低，抑制效果增强。
综合以上实验结果，本发明中所述化合物epigycosideb可以显著抑制cona或lps分别诱导的balb/c小鼠脾脏t淋巴细胞和b淋巴细胞的增殖。本发明中所述化合物epigycosideb具有优秀的免疫抑制活性，可以用于免疫抑制制剂的制备。
实施例4：体外抗炎活性试验
(1)试验相关试剂的配制
样品稀释工作液的配制：浓缩样品稀释液自-4℃冰箱中取出，室温缓慢解冻，按照试验所需用量取部分使用双蒸水按照1:5的比例稀释。
试剂稀释工作液的配制：浓缩试剂液自-4℃冰箱取出，室温放缓慢解冻，按照试验所需用量取部分使用双蒸水按照1:5的比例稀释。
细胞裂解工作液的配制：浓缩细胞裂解液自-4℃冰箱取出，室温缓慢解冻，按照试验所需用量取部分使用双蒸水按照1:2的比例稀释。
洗涤工作液的配制：浓缩洗涤液自-4℃冰箱取出，室温放置半小时，轻摇使其溶解均匀，按照试验所需用量取部分使用双蒸水按照1:20的比例稀释。
生物素化抗体工作液的配制：浓缩生物素化抗体自-20℃冰箱取出，室温放置半小时，瞬时离心，使其溶解并沉淀到管底部，加入100μl1×试剂稀释工作液，用枪头轻轻的吹打数次，使其充分溶解。按照试验所需用量取部分使用双蒸水按照1:80的比例稀释。
辣根过氧化物酶工作液的配制：浓缩辣根过氧化物酶自-20℃冰箱取出，室温放置半小时，瞬时离心后移液枪吹打使充分溶解。按照试验所需用量取部分使用双蒸水按照1:200的比例稀释。
(2)样品的准备
样品在使用前，必须至少需要用1×样品稀释工作液稀释5-10倍。
(3)标准品的准备
标准品的使用必须遵循现配现用原则；
a.标准品必须在-20℃或者-80℃冰箱中保存；
b.将标准品从冰箱-20℃拿出来，室温放置半小时，瞬时离心，使其全部沉淀到管底部，加入1x样品稀释工作液；
c.轻轻的震荡数次，确保标准品粉末全部、充分溶解，此时浓度为10ng/ml，标记为母液；
d.以母液为基础，依次按照5倍稀释成6个梯度浓度；
e.用1x样品稀释工作液作为对照组(浓度为0)；
f.按照实际实验所需用量配制每一浓度的最终用量。
(4)细胞培养及实验分组
raw264.7细胞使用dmem完全培养液(添加10％胎牛血清，1％双抗)于37℃，5％co2环境培养箱内培养至对数期使用。取对数生长期raw264.7细胞加dmem培养基调整浓度后，以2×104个/孔的标准加入96孔板中。继续培养24h后，加入不同浓度的各样品；本试验受试化合物试验浓度分别设置为0.4μg/ml、1μg/ml、5μg/ml。采用地塞米松(终浓度10μg/ml)作为阳性对照，pbs做阴性对照。继续孵育2h后加lps使其终浓度为5μg/ml，继续培养24h，收集培养基上清进行检测。
具体实验分组如下：
阴性对照组：细胞悬液+pbs+lps
阳性对照组：细胞悬液+lps+地塞米松
空白对照组：细胞悬液
受试样品组：细胞悬液+各浓度受试样品+lps
每个实验组做三组平行试验。
(5)elisa法检测培养基上清il-1β、pge2、tnf-α的表达水平elisa双抗体夹心法，具体操作步骤如下：
1)取出酶标板条以及实验所需试剂，恢复至室温，每孔按照实验设计加入100μl对应的稀释后的标准品以及样品。封板膜封板后，室温孵育2.5小时；
2)吸去各孔液体，每孔加入300μl洗涤工作液，洗涤4次，在干净纸上用力拍打，确保彻底清除孔内液体；
3)每孔加入100μl稀释后的生物素化抗体工作液，轻轻摇晃，封板膜封板后，室温孵育1小时，去除液体后洗涤4次；
4)每孔加入100μl稀释后的辣根过氧化物酶工作液，轻轻摇晃，封板膜封板后，室温孵育45分钟，去除液体后洗涤4次；
5)每孔加入100μl稀释后的辣根过氧化物酶工作液，轻轻摇晃，封板膜封板后，室温孵育45分钟；
6)每孔加入100μl显色剂，封板膜封板后，室温孵育30分钟；
7)每孔加入50μl终止液，在酶标仪上检测450nm处吸光度；
8)根据酶标仪上读取的标准品od值，绘制标准曲线和回归方程，并根据样品的od值计算出各因子的表达含量。
(6)数据处理
spss17.0统计软件分析，数值以均x±se表示，不同组间的变化用t检验验证其差异性；使用origin8.0绘图(*p<0.05则表示与阴性对照组存在显著性差异)。
(7)实验结果
表4：化合物epigcosideb对raw264.7细胞炎症因子表达水平的影响
阳性对照药物地塞米松在为10μg/ml的作用浓度下，炎症raw264.7细胞tnf-α、il-1β、pge2的表达水平分别为14.29ng/l、4.61ng/l、11.32ng/l。
化合物epigycosideb在作用浓度为0.4μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml时，试验组tnf-α的表达水平分别为17.10ng/l、16.77ng/l、16.27ng/l，与阴性对照组19.75ng/l的表达量相比，皆具有显著性差异(p<0.05)。
化合物epigycosideb在作用浓度为0.4μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml时，试验组il-1β的表达水平分别为5.27ng/l、4.77ng/l、3.88ng/l，与阴性对照组相比具有显著性差异，且与阳性对照组地塞米松10μg/ml作用结果4.61ng/l比较，epigycosideb在1.0μg/ml浓度下，作用后il-1β的表达水平与阳性对照作用后相当，在5.0μg/ml作用浓度下il-1β表达水平则已经低于阳性对照作用结果。
化合物epigycosideb在作用浓度为0.4μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml时，试验组pge2的表达含量分别为14.37ng/l、13.69ng/l、12.11ng/l，与阴性对照组16.72ng/l的表达量相比，皆具有显著性差异(p<0.05)。
实验结果表明，本发明中如式ii所示化合物epigycosideb在0.4μg/ml-5.0μg/ml的作用浓度下对lps诱导的炎症raw264.7细胞的tnf-α、il-1β、pge2因子的表达水平具有调节作用，可以抑制其表达，减弱炎症反应，且在5.0μg/ml的作用浓度下，效果与阳性药品地塞米松相当。本发明中所述化合物epigycosideb具有显著的体外抗炎活性，可以用于抗炎药物的制备。