干扰IFN-gama表达的CD19-CAR-T细胞及其应用的制作方法

文档序号：15857148发布日期：2018-11-07 11:11阅读：511来源：国知局

本发明涉及干扰ifn-gama表达的靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcell，car-t)的制备及应用，属于基因工程和细胞生物学领域。

背景技术

1989年，嵌合抗原受体改造t细胞(car-t)这一概念被首次提出，目的是建立肿瘤特异性识别能力的过继细胞疗法。第一代car的设计是简单的用特异性单克隆抗体来源的scfv(single-chainantibodyvariableregionfragment)段替换tcr(tcellreceptor)的胞外区部分，保留了跨膜结构和胞内传递信号的cd3ζ区域，有的研究组胞内信号传递部分也会采用fcr。但第一代car的临床试验结果却非常令人失望，效果最好的一次临床试验也仅仅有2/11个病人有长期的缓解。随着对免疫学认识的不断深入，人们发现cd3ζ信号虽然能够诱导t细胞的活化和短暂增殖，但之后会诱导t细胞的无能(anergy)。1998年，有两个实验室报道了cd28信号结构域可以为cd3ζ信号提供辅助的共刺激功能。因此，第二代car的设计在第一代的基础上引入了共刺激分子的部分，如cd28或cd137(4-1bb)的胞内信号结构域。而第三代car则是加入了2个共刺激分子的功能信号结构域，包括cd27、cd28、4-1bb、icos或ox40(15-18)。现在在临床上进行实验的主要是第二代car的设计。

car-t的疗效已经被业内所公认，2017年8月30日，美国fda批准了首个car-t药物——kymriah(tisagenlecleucel)，用于治疗复发或难治性(r/r)儿童和年轻成人b细胞急性淋巴细胞白血病。这是首个获批的免疫细胞药物。一个多月后的10月18日，fda批准kite制药yescarta(axicabtageneciloleucel，kte-c10)，用于治疗对其他疗法无响应或者接受过至少2种治疗方案后复发的特定类型成人大b细胞淋巴瘤患者,包括弥漫性大b细胞淋巴瘤、转化型滤泡性淋巴瘤、原发纵隔b细胞淋巴瘤。yescarta是fda批准的第2款car-t疗法。

与cd-19-car-t疗法的有效性共存的是它的副作用和细胞毒性。由于设计时选取cd19为靶点，输入的t细胞会将体内本身存在的正常b细胞与肿瘤细胞一起杀掉，并且在肿瘤消失后，只要car-t细胞依然存在，机体内都不会有正常b细胞存活，病人需要间隔一定时间注射免疫球蛋白以维持基本的体液免疫。另一方面，在car-t细胞输入初期，由于t细胞的大量扩增以及t细胞杀伤肿瘤过程中会分泌大量细胞因子，病人会出现细胞因子释放综合症(cytokinereleasesyndrome，crs)，具体表现为发热、低血压、缺氧以及血清中某些细胞因子水平显着升高，这些因子包括干扰素-γ(ifn-gama)，分形趋化因子(fracktalkine)，粒-巨噬细胞生长因子(gm-csf)，白细胞介素-5(il-5)，白细胞介素-6(il-6)，人fms样酪氨酸激酶3配体(flt-3l)和白细胞介素-10(il-10)。2016年7月初，总部位于西雅图的junotherapeutics发布了报道在该公司进行的临床试验jcar015中，先后有三位病人(后被证实是四位)在接受car-t细胞治疗后发生死亡，fda随即停止了jcar015的临床试验，juno随后解释是因为使用化疗药物氟达拉滨导致神经毒素，但也有很多人猜测是由于输入的t细胞所产生的强烈细胞因子风暴(crs)导致病人死亡。瑞士著名的诺华(novartis)公司的靶向cd-19的产品clt019虽然能够让80％的患者病情得到缓解，但同时也会导致近一半的患者出现细胞激素释放症(crs)。出现crs的患者体内，t细胞会释放过多的炎症因子，导致过激的炎症反应和发烧，严重的话会危及生命。同样的，美国加州的kitepharma公司用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的产品kte-c19，会导致1/3的患者出现神经系统副作用、1/5的患者出现crs，还有两名患者在测试中死亡。

通常来说，采用大剂量类固醇激素，如强的松，可以迅速逆转crs的临床症状。但是，类固醇药物会显著抑制car-t细胞在体内的增殖，使得患者有较高的复发率，影响car-t治疗的疗效。现在临床上处理crs较好的治疗药物是白细胞介素-6受体(il-6r)的阻断性单克隆抗体药物(tocilizumab)。已有临床试验证明，阻断il-6受体后能迅速解决crs带来的毒副作用并且对car-t细胞体内增殖没有影响。目前fda已正式批准tocilizumab用于治疗car-t疗法中可能会出现的crs风险。但是tocilizumab价格昂贵，对患者来说是不小的经济负担，因此，如果能够从源头上切断ifn-gama细胞因子的释放，就能很大程度上减轻crs的风险，增强car-t治疗的安全性。

rna干扰(rnainterference，rnai)是一种普遍存在于生物体内、序列特异性强、转录后水平的基因沉默机制。目前，应用较为普遍的发挥干扰作用的小rna分子在动物体内主要有sirna(smallinterferingrna)、shrna(shorthairpinrna)和amirna(artificialmicrorna)等。最早采用rnai技术研究生物体内基因功能的方法是将体外制备好的单链sirna分子直接注入线虫体内，虽然后来在基因功能研究中被沿用，但是这种方法的干扰时效性相对较短，为达到有效干扰而提高sirna的浓度又往往有细胞毒性。现在的rnai技术采用的方法多为构建一个特定的rnai表达载体，该载体导入动植物细胞后能由rna聚合酶ii型或iii型启动子转录出相应的shrna，amirna等，进而干扰其靶基因的表达。

目前，普遍用于构建shrna干扰表达载体的方法主要有以下两种：(1)寡核苷酸退火法，普遍做法是化学合成两条特定的寡核苷酸引物，在离体条件下退火形成两端带有黏性末端的双链shrna片段，然后与经过酶切处理同样带有黏性末端的载体连接转化，得到含有shrna感染表达单元的重组质粒。(2)pcr扩增法：设计一对扩增控制shrna表达启动子的pcr引物，其中正向引物与启动子特异性匹配，反向引物5’末端额外加上针对目的基因的干扰靶序列，将pcr产物克隆到相应的载体上，得到shrna干扰表达载体。

干扰素-gama(ifn-gama)作为细胞因子释放综合症(cytokinereleasesyndrome，crs)中发挥重要作用的细胞因子，设计针对ifn-gama的shrna，通过基因沉默技术从源头抑制ifn-gama的释放，从而降低crs的影响，是提高car-t安全性，降低毒副作用的有益思路。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的发明人经过深入的研究和创造性的劳动，成功筛选出了2种能够干扰ifn-gama基因表达的shrna，并将该shrna和cd19car共表达。本发明的发明人发现，共表达了干扰ifn-gama基因表达的shrna的cd19car-t细胞，杀伤表达cd19的肿瘤细胞的过程中il-6，ifn-gama等因子的释放量降低，从而在源头上降低了crs的影响，提高car-t治疗中的安全性。

本发明是通过以下技术方案实现的：

干扰人ifn-gama基因表达的shrna，有两种，分别命名为ifn-gamashrna-1、ifn-gamashrna-3，ifn-gamashrna-1的核苷酸序列如下所示(本发明中所涉及的序列，若无特别说明，均为5’-3’)，ifn-gamashrna-3的核苷酸序列如下所示。

ifn-gamashrna-1(如seqidno:1所示)：

gcggccgccgcagagccaaattgtctccttttcaagagaaaggagacaatttggctctgcttttt。

ifn-gamashrna-3(如seqidno:2所示)：

gcggccgcccattcagatgtagcggataatttcaagagaattatccgctacatctgaatgttttt。

ifn-gamashrna-1的序列中，包含针对人ifn-gama基因的sirna：gcagagccaaattgtctcctt。ifn-gamashrna-3的序列中，包含针对人ifn-gama基因的sirna：cattcagatgtagcggataat。

一种用于制备上述干扰人ifn-gama基因表达的shrna——ifn-gamashrna-1的引物，其核苷酸序列如下所示(如seqidno:5～8所示)：

hifn-gama-shrna1-1^st：ggccgccgcagagccaaattgtctccttttcaagaga；

hifn-gama-shrna1-2^nd：aaggagacaatttggctctgctttttgc；

hifn-gama-shrna1-3^rd：aaggagacaatttggctctgcggc；

hifn-gama-shrna1-4^th：ggccgcaaaaagcagagccaaattgtctcctttctcttgaa。

一种用于制备上述干扰人ifn-gama基因表达的shrna——ifn-gamashrna-3的引物，其核苷酸序列如下所示(如seqidno:9～12所示)：

hifn-gama-shrna3-1^st：ggccgcccattcagatgtagcggataatttcaagaga；

hifn-gama-shrna3-2^nd：attatccgctacatctgaatgtttttgc；

hifn-gama-shrna3-3^rd：attatccgctacatctgaatgggc；

hifn-gama-shrna3-4^th：ggccgcaaaaacattcagatgtagcggataattctcttgaa。

利用上述shrna引物制备干扰人ifn-gama基因表达的shrna的方法：将上述4条引物(由苏州金唯智生物科技有限公司合成)干粉快速离心，之后加水稀释到100um,1^st，2^nd，3^rd，4^th，各取2.5ul,四条共计10ul，补水到50ul，煮沸5～10分钟，放在锅里自然冷却过夜至室温，经过该过程，四条引物完成退火，形成一段dna双链短片段。

一种嵌合抗原受体，包括以下顺式串联的结构域：信号肽、标签基因、单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区，其中，单链抗体包括轻链可变区(vl)、重链可变区(vh)以及连接它们的铰链区。

所述单链抗体所识别的抗原选自cd19、cd20、cea、gd2、cd22、cd23、cd30、cd33、cd44v7/8、cd70、vegfr1、vegfr2、il-11rα、egp-2、egp-40、fbp、gd3中的任意一种或两种以上(这些抗原均为现有技术中已有的)，优选cd19，此时，所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如下所示，重链可变区的氨基酸序列如下所示，铰链区的氨基酸序列如下所示。

单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列：

kliseedldiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleit。

单链抗体的重链可变区的氨基酸序列：

evklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvss。

单链抗体的铰链区的氨基酸序列：ggggsggggsggggs。

所述信号肽的氨基酸序列为：malpvtalllplalllhaarpeq。

所述标签基因的氨基酸序列为：kliseedlts。

所述胞外铰链区选自cd8的胞外铰链区、cd28的胞外铰链区或cd4的胞外铰链区中的任意一种或两种以上，优选cd8的胞外铰链区；所述cd8的胞外铰链区的氨基酸序列为：tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdi。

所述跨膜区选自cd8的跨膜区、cd28的跨膜区或cd4的跨膜区中的任意一种或两种以上；优选cd8跨膜区；所述cd8跨膜区的氨基酸序列为：yiwaplagtcgvlllslvitlyc。

所述胞内信号区选自cd28、cd134/ox40、cd137/4-1bb、lck、icos、dap10、cd3ζ和fcεriγ中的任意一种或两种以上，优选4-1bb胞内信号区和cd3ζ胞内信号区，或：cd28胞内信号区和cd3ζ胞内信号区；所述4-1bb胞内信号区和cd3ζ胞内信号区的氨基酸序列分别如下所示。

4-1bb胞内信号区的氨基酸序列：slkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggce。

cd3ζ胞内信号区的氨基酸序列：

lrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprg。

上述的氨基酸序列均为现有技术中已有的。

优选的，所述嵌合抗原受体，其氨基酸序列如下所示(如seqidno:3所示)。

seqidno:3：

malpvtalllplalllhaarpeqkliseedldiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycslkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprg。

一种编码上述嵌合抗原受体的核苷酸片段，其核苷酸序列如下所示(如seqidno:4所示)。

seqidno:4：

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggagcagaagctgatcagcgaggaggacctgactagtgacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaggatccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgctccctaaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcggctaa。

一种慢病毒表达载体，其包含有上述干扰人ifn-gama基因表达的shrna，shrna表达框，以及编码上述嵌合抗原受体的核苷酸片段(该慢病毒表达载体可同时表达嵌合抗原受体和ifn-gamashrna)；所述shrna表达框包含shrna表达启动子，shrna表达启动子选自u6、h1或7sk中的任意一种，优选u6；所述u6启动子的核苷酸序列如下所示。该慢病毒表达载体的构建方法，为常规方法。

u6启动子的核苷酸序列：

aaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgggtttatatatcttgtggaaaggacg。

优选的，所述慢病毒表达载体的结构为phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-1，或phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-3。

一种shrna的筛选方法，采用phr-ifn-gama-gfp和phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna质粒共转染的方式，通过磷酸钙转染法，将cacl2、两种质粒和水按照一定比例混合，缓慢滴加到293ft细胞的培养上清里，24h后收获293ft细胞，分别通过rt-pcr和流式检测的方法在mrna和蛋白水平检测il-6的表达。

所述慢病毒载体phr-ifn-gama-gfp，其包含有ifn-gama基因，以及gfp基因(可同时表达ifn-gama和gfp)。所述ifn-gama基因，其核苷酸序列如下所示。所述gfp基因，其核苷酸序列如下所示。

ifn-gama基因的核苷酸序列：

gfp基因的核苷酸序列：

gtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag。

所述通过rt-pcr法检测ifn-gama的表达的方法如下：收获293ft细胞后，提取总rna(minibestuniversalrna,takara,cat:9767)，反转录成cdna(fastkingrtkit，天根，cat：kr11601)，利用ifn-gama的引物，通过荧光定量pcr的方法测定mrna水平上ifn-gama的表达(需用到内参基因β-actin的引物)。

所述ifn-gama的引物，包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列如下所示：ifn-gama-f:tcagctctgcatcgttttgg；ifn-gama-r:gttccattatccgctacatctgaa。

所述内参基因β-actin的引物，其核苷酸序列如下所示：action-f：cgccccaggcaccagggc；action-r：gctggggtgttgaaggt。

所述流式法检测ifn-gama的表达的方法如下：收获293ft细胞后，检测gfp的荧光表达。

一种慢病毒表达试剂盒，包括上述的慢病毒表达载体。

一种利用上述慢病毒表达载体制备重组慢病毒的方法：将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体、pcmv载体和pmd.2g载体混合后转染到293ft细胞中，转染后6～8h更换为完全培养基培养，48h后收集培养液，离心后保留上清并用0.45μm过滤头过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。

一种干扰ifn-gama表达的cd19-car-t细胞，为包含有上述慢病毒表达载体的t淋巴细胞，或染色体中整合有干扰人ifn-gama基因表达的shrna，以及编码嵌合抗原受体的核苷酸片段的t淋巴细胞(可同时表达ifn-gamashrna和嵌合抗原受体)。该重组t细胞的制备方法为常规方法。

所述干扰il-6表达的cd19-car-t细胞在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的应用；优选地，所述恶性肿瘤选自急性淋巴细胞白血病和/或慢性淋巴细胞白血病。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供了一种将shrna插入表达载体的方法，即通过4引物退火法合成一段dna双链短片段。

2.本发明提供了一种检测筛选shrna的有效方法，即通过表达ifn-gamashrna的载体phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna和表达ifn-gama-gfp融合蛋白的载体phr-ifn-gama-gfp共转染的方式，通过rt-pcr和流式的方法，分别在mrna和蛋白水平检测ifn-gamashrna基因沉默的效率，成功筛选出能有效沉默ifn-gama基因表达的shrna。

3.与现有的anticd19car-t细胞相比，本发明引入了ifn-gamashrna，在表达car的同时，共表达ifn-gama的shrna，通过基因沉默技术从源头抑制ifn-gama的释放，从而降低crs的影响，提高car-t治疗的安全性。

4.与现有的anticd19car-t细胞相比，phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞在表达car的同时，共表达ifn-gama的shrna，实验结果表明，共表达的ifn-gama的shrna能够降低il-6，ifn-gama等因子释放，控制crs副作用的产生，增加其安全性的同时，不影响car的表达，没有影响其杀伤等方面的特性，出乎本领域技术人员的预料。

本发明中涉及的一些常用术语的说明如下；

术语“shrna”(shorthairpinrna)，即短发夹rna。shrna包括两个短反向重复序列。克隆到shrna表达载体中的shrna包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅲ启动子控制。随后再连上5-6个t作为rna聚合酶ⅲ的转录终止子。

术语“u6启动子”是polⅲ启动子中的一种，其位置和碱基序列高度保守，能够在细胞内高效转录下游结构基因。是shrna常用的启动子。

术语“嵌合抗原受体”是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如t细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。

术语“单链抗体”(single-chainantibodyvariableregionfragment,scfv)是指由抗体轻链可变区(vl区)氨基酸序列和重链可变区(vh区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。

术语“linker”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。

术语“cd19”是指人白细胞分化抗原19，它在ncbigenebank的id号为930，有2个异构体(cdna序列/蛋白序列)，分别为nm_001178098.1/np_001171569.1，nm_001770.5/np_001761.3。当提及cd19的氨基酸序列时，其包括，cd19蛋白的全长或者具有cd19功能的cd19的片段；还包括所述全长或片段的融合蛋白。并且，本领域技术人员理解，在cd19的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。并且，当描述cd19的蛋白序列片段时，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。

附图说明

图1：ifn-gamashrna和cd19car双表达载体结构图。

图2：phr-ifn-gama-gfp载体模式图。

图3：phr-ifn-gama-gfp转染效率流式图。

图4：phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna转染效率流式图。

图5：共转染后rt-pcr法检测ifn-gama表达图。

图6：共转染后流式法检测ifn-gama表达图，其中，左图为转染效率流式图，右图为转染效率条形图。

图7：phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞阳性率流式检测图

图8：k562-cd19单克隆流式检测图。

图9：phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞特异性杀伤cd19阳性的肿瘤细胞流式图。

图10：phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞特异性杀伤cd19阳性的肿瘤细胞统计图。

图11：rt-pcr法检测phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞因子含量。

图12：elisa检测phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞因子含量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：能够克隆至载体的ifn-gamashrna的合成

在sigma-aldrich中国官网上查询ifn-gamashrna的序列，选取其中的4条(gama-1、gama-2、gama-3、gama-4)，其核苷酸序列分别如下所示。

gama-1：ccgggcagagccaaattgtctccttctcgagaaggagacaatttggctctgctttttg。

gama-2：ccggtataagtgaagtgatactatcctcgaggatagtatcacttcacttatatttttg。

gama-3：ccggcattcagatgtagcggataatctcgagattatccgctacatctgaatgtttttg。

gama-4：ccggggttgtcctgcctgcaatattctcgagaatattgcaggcaggacaacctttttg。

其中，下划线标出的序列为每条中sirna的序列。

本发明采用传统的克隆至载体的方法，将两条编码ifn-gamasirna序列的dna寡核苷酸插入到载体中。该dna寡核苷酸含有21个核苷酸长的正义sirna序列，通过ambion的科学家已成功地使用的9个核苷酸的间隔序列ttcaagaga与其反向互补的反义sirna序列相连，在其寡核苷酸的3’末端加上5个t作为终止信号，并在设计时加入克隆至载体所需酶切位点noti。

本发明采用4引物退火合成法，分别为每条shrna序列设计4条引物，ifn-gamashrna-1引物序列如seqidno:5～8所示。ifn-gamashrna-2引物序列如下所示。ifn-gamashrna-3引物序列如seqidno:9～12所示。ifn-gamashrna-4引物序列如下所示。

ifn-gamashrna-2引物序列如下：

hifn-gama-shrna2-1^st：ggccgcctataagtgaagtgatactatcttcaagaga；

hifn-gama-shrna2-2^nd：gatagtatcacttcacttatatttttgc；

hifn-gama-shrna2-3^rd：gatagtatcacttcacttataggc；

hifn-gama-shrna2-4^th：ggccgcaaaaatataagtgaagtgatactatctctcttgaa。

ifn-gamashrna-4引物序列如下：

hifn-gama-shrna4-1^st：ggccgccggttgtcctgcctgcaatattttcaagaga；

hifn-gama-shrna4-2^nd：aatattgcaggcaggacaacctttttgc；

hifn-gama-shrna4-3^rd：aatattgcaggcaggacaaccggc；

hifn-gama-shrna4-4^th：ggccgcaaaaaggttgtcctgcctgcaatatttctcttgaa。

每条shrna的4条引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，然后将合成的4条引物干粉快速离心，之后加水稀释到100um,1^st，2^nd，3^rd，4^th，各取2.5ul,四条共计10ul，补水到50ul，煮沸5～10分钟，放在锅里自然冷却过夜至室温，经过该过程，四条引物完成退火，形成一段dna双链短片段。

经过该过程后形成的dna双链短片段，ifn-gamashrna-1，其序列如seqidno:1所示；ifn-gamashrna-2，其序列如下所示；ifn-gamashrna-3，其序列如seqidno:2所示；ifn-gamashrna-4，其序列如下所示。

ifn-gamashrna-2：

gcggccgcctataagtgaagtgatactatcttcaagagagatagtatcacttcacttatattttt。

ifn-gamashrna-4：

gcggccgccggttgtcctgcctgcaatattttcaagagaaatattgcaggcaggacaaccttttt。

实施例2：ifn-gamashrna和cd19car双表达载体的构建

如图1所示，将cd8穿膜信号肽、myc标签、anti-cd19scfv、cd8跨膜区、4-1bb共刺激信号区和cd3zetatcr激活区、u6启动子、ifn-gamashrna依序克隆到慢病毒骨架质粒phr中，得到phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna质粒(实验所涉及的ifn-gamashrna有四种，所以得到的质粒也有四种，分别如下)。

cd8amyc-anti-cd19scfv-cd8tm-4-1bb-cd3zeta-u6-ifn-gamashrna-1的核苷酸序列如下所示(如seqidno:13所示)。

seqidno:13：

cd8amyc-anti-cd19scfv-cd8tm-4-1bb-cd3zeta-u6-ifn-gamashrna-2的核苷酸序列如下所示：

cd8amyc-anti-cd19scfv-cd8tm-4-1bb-cd3zeta-u6-ifn-gamashrna-3的核苷酸序列如下所示(如seqidno:14所示)。

seqidno:14：

cd8amyc-anti-cd19scfv-cd8tm-4-1bb-cd3zeta-u6-ifn-gamashrna-4的核苷酸序列如下所示：

实施例3：phr-ifn-gama-gfp筛选质粒的制备

如图2所示，将ifn-gama、gfp依序克隆到慢病毒骨架质粒phr中，得到phr-ifn-gama-gfp质粒。所述phr-ifn-gama-gfp中gfp为报告基因，用来检测ifn-gama的基因沉默的效率。

ifn-gama-gfp融合蛋白的核苷酸序列如下所示：

atgaagtacaccagctacatcctggcctttcagctgtgcatcgtgctgggcagcctgggctgctactgccaggacccctacgtgaaggaggccgagaacctgaagaagtacttcaacgccggccacagcgacgtggccgacaacggcaccctgttcctcggcatcctgaagaactggaaggaggagagcgacaggaagatcatgcagtcccagatcgtgagcttctacttcaagctgttcaagaatttcaaggacgaccagagcatccagaagagcgtggagaccatcaaggaggacatgaacgtgaagtttttcaatagcaacaagaagaagagggacgacttcgagaagctgaccaactacagcgtgaccgacctgaatgtgcagaggaaggccatccacgaactgatccaggtgatggccgagctgagccctgccgccaagaccggcaagaggaagaggagccagatgctgttcaggggcaggagggccagccagggatccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa。

实施例4：有效沉默ifn-gama表达的phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna慢病毒载体的筛选

(1)phr-ifn-gama-gfp筛选质粒的转染

采用磷酸钙转染法，将cacl2、质粒和水按照一定比例混合，缓慢滴加到293ft细胞的培养上清里，24h后流式检测293ft，检测ifn-gama-gfp融合蛋白的荧光表达。如图3所示phr-ifn-gama-gfp的转染效率为48.3％，能够成功转染。

(2)phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna质粒的转染

采用磷酸钙转染法，将cacl2、质粒和水按照一定比例混合，缓慢滴加到293ft细胞的培养上清里，24h后取293ft细胞，流式细胞仪检测car阳性的细胞比例(fluorescein(fitc)affinipuregoatanti-mouseigg,f(ab')2fragmentspecific，jacksonimmunoresearch，cat：115-095-006)。如图4所示，和阴性对照组相比，4种phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna质粒的转染效率分别为19.8％，25％，20.6％，15.7％。都能够成功转染。

(3)rt-pcr法筛选ifn-gamashrna

采用phr-ifn-gama-gfp和phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna质粒共转染的方式，通过磷酸钙转染法，将cacl2、2种质粒和水按照一定比例混合，缓慢滴加到293ft细胞的培养上清里，24h后收获293ft细胞，提取总rna(minibestuniversalrna,takara,cat:9767)，反转录成cdna(fastkingrtkit，天根，cat：kr11601)，利用ifn-gama的引物(如前所示)，通过荧光定量pcr的方法测定mrna水平上ifn-gama的表达(需用到内参基因β-actin的引物，如前所示)。

如图5所示，和phr-ifn-gama-gfp单独转染的293ft相比，phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-1质粒、phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-3质粒和phr-ifn-gama-gfp共转染后的293ft中ifn-gama的水平明显降低。统计学分析显示ifn-gama的水平有显著差异。表明这2种phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna能够在mrna水平有效降低phr-ifn-gama-gfp中ifn-gama的表达，发挥基因沉默的作用。

(4)流式法ifn-gamashrna的筛选

采用phr-ifn-gama-gfp和phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna质粒共转染的方式，通过磷酸钙转染法，将cacl2、2种质粒和水按照一定比例混合，缓慢滴加到293ft细胞的培养上清里，24h后流式检测293ft，检测ifn-gama-gfp融合蛋白的荧光表达。如图6所示，和phr-ifn-gama-gfp单独转染17％的转染效率相比，phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-1质粒、phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-3质粒和phr-ifn-gama-gfp共转染后gfp的转染效率显著下降为7.55％，4.16％。表明这2种phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna能有效降低phr-ifn-gama-gfp中ifn-gama的蛋白表达，发挥基因沉默的作用。

实施例5：慢病毒的包装及浓缩

将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体(phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-1质粒和phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-3质粒)、pcmv载体和pmd.2g载体混合后转染到293ft细胞中，转染后6～8h更换为完全培养基培养，48h后收集培养液，离心后保留上清并用0.45μm滤器过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。

慢病毒浓缩根据lenti-xtmconcentrator(takara，cat:631231)说明书进行。

实施例6：ifn-gamashrna和cd19car双表达载体的t细胞的制备

取50ml新鲜血液，通过淋巴细胞分离液(天津灏洋)进行密度梯度离心来分离单个核细胞。将单个核细胞重悬至x-vivo15培养基(lonza)中，同时添加cd3单抗和cd28单抗来激活t淋巴细胞，37℃5％co2培养48小时。

取2×10⁶的细胞，按照moi＝5加入实施例5中浓缩的2种慢病毒，同时加入il-2和polybrene，混匀，37℃5％co2培养6-8小时，300g5min离心换液为新鲜x-vivo15培养基(含il-2)。

每2-3天加入新鲜x-vivo15培养基(含il-2)，维持细胞密度在1×10⁶/ml左右，扩增10-12天。

取病毒感染后培养48h的t细胞和未感染病毒的t细胞各5×10⁵，每个样品加fluoresceinaffinipuregoatanti-mouseigg,f(ab')2fragmentspecific1ul，室温避光孵育15min，离心，沉淀用200μlpbs重悬后上机检测(milliporeguavaeasycyteht)。结果如图7所示，病毒感染后培养48h的t细胞中2种phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞的比例为84.9％、86.6％，感染效率很高。将该实施例中制备的2种t细胞命名为phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-1-t和phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-3-t，作为以后实施例中所用到的细胞。

实施例7：phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞对肿瘤细胞株的体外杀伤试验

1.稳定表达cd19基因的k562细胞(靶细胞)的构建

(1)合成cd19胞外区及跨膜区的dna编码序列，插入phr载体，构建获得的载体命名为phr-cd19。

cd19胞外区及跨膜区的核苷酸编码序列如下所示：

atgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtctcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctcaccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtccaggggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatggagacgggtctgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtggcaacctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccagtactatggcactggctgctgaggactggtggctggaaggtctcagctgtgactttggcttatctgatcttctgcctgtgttcccttgtgggcattcttcatcttcaaagagccctggtcctgagg。

(2)慢病毒包装和浓缩

将所述phr-cd19载体、pcmv载体和pmd.2g载体混合后转染到293ft细胞中，转染后6～8h更换为完全培养基培养，48h后收集培养液，离心后保留上清并用0.45μm滤器过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。

慢病毒浓缩根据lenti-xtmconcentrator(takara，cat:631231)说明书进行。

(3)表达cd19的k562细胞的制备

1640(gibco)培养基重悬k562细胞至1x10⁶/ml，加入慢病毒(moi5-10)，37℃、5％co2培养箱培养6-8h，离心换液为新鲜k562细胞增殖培养液。每2-3天加入新鲜k562细胞增殖培养液，维持细胞密度在0.5x10⁶/ml左右。5代后，应用有限稀释法进行单克隆筛选。待单克隆细胞长至一定数量后，通过流式细胞仪进行筛选(anti-cd19pe，biolegendcat：302254)，表达量高且纯度高的细胞克隆，即为稳定表达cd19的k562细胞，命名为k562-cd19(如图8所示)，作为本实施例中的靶细胞。

2.phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t的杀伤功能体外验证

将k562细胞及构建的k562-cd19细胞按1:1接种于96孔板中，按e:t＝1:1、3:1分别接种培养9天的phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-1-t、phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-3-t、anticd19car-t细胞和t细胞。37℃5％co2培养24小时，每孔吸取100μl上清液-80℃保存备用。剩余细胞每孔加入peanti-humancd19(biolegend)和fitcanti-humancd3(biolegend)，室温避光孵育15min，离心，沉淀用200μlpbs重悬后上机检测(milliporeguavaeasycyteht)。结果如图9及图10所示，2组phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞对k562-cd19细胞有特异性杀伤，效靶比为1:1、3:1时特异性杀伤效率均值分别为56.7％、100％和63.3％、100％，杀伤率随效靶比的增加而升高。统计学分析显示，2组phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞和t细胞组之间的特异性杀伤效率有显著差异，而phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t和anticd19car-t细胞组之间的特异性杀伤效率无显著差异。

实施例8：phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞细胞因子含量检测

1)rt-pcr法检测phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞因子释放

取培养9天的phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-1-t、phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-3-t和anticd19car-t细胞，提取总rna(minibestuniversalrna,takara,cat:9767)，反转录成cdna(fastkingrtkit，天根，cat：kr11601)，利用il-6的引物(如下所示)、ifn-gama的引物(如前所示)、il-2的引物(如下所示)、管家基因β-action的引物(如前所示)，通过荧光定量pcr的方法测定mrna水平上il-6、ifn-gama、il-2的表达。

rt-pcr中il-6的引物序列如下所示：il-6-f:agacagccactcacctcttcag；il-6-r:ttctgccagtgcctctttgctg。

rt-pcr中il-2的引物序列如下所示：il-2-f:aactcaccaggatgctcacattta；il-2-r:tccctgggtcttaagtgaaagttt。

如图11所示，和cd19car-t细胞相比，phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞能在mrna水平显著降低ifn-gama、il-6和il-2的释放，发挥基因沉默il-6的作用。

2)elisa法检测phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞培养上清中分泌因子含量

取实施例7中e:t＝3:1体外杀伤试验所留上清液，分别为t细胞组、anticd19car-t细胞组、phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-1-t细胞组、phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-3-t细胞组和肿瘤细胞的阴性对照组的上清液，按humanil-2elisamax^tmdeluxe(biolegend，431804)、humanifn-gamaelisamax^tmdeluxe(biolegend，430104)、humanil-6elisamax^tmdeluxe(biolegend，430504)试剂盒说明书操作，检测ifn-gama、il-6和il-2的释放。

结果如图12所示，phr-anticd19car-u6-ifn-gamashrna-t细胞和cd19car-t细胞相比能显著降低ifn-gama的释放。降低il-6的释放。而对il-2的释放没有明显影响。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

序列表

<110>山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司

<120>干扰ifn-gama表达的cd19-car-t细胞及其应用

<141>2018-04-27

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>65

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

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ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcag480

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ggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctg600

gagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatcc660

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caaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctat780

gctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaggatccaccacgacg840

ccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgc900

ccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcc960

tgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactg1020

gttatcaccctttactgctccctaaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaa1080

caaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgattt1140

ccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcc1200

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cagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccc1500

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