一种快速区分猪圆环病毒2型和3型的二重PCR检测引物及试剂盒的制作方法

文档序号:15457617发布日期:2018-09-15 01:34

技术领域

本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域,具体为针对猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型一步法二重PCR的检测引物、检测试剂盒及应用。



背景技术:

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)为一种共价闭合、单股环状DNA病毒,是迄今发现最小动物病毒。2015年前,全球范围内仅发现PCV1和PCV2两个基因型。其中,PCV1被认为是猪肾细胞PK-15污染物,但不产生细胞病变效应,对猪无致病性。PCV2能引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD),主要有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、增生性坏死性肺炎(PNP)和肠炎等。临床上PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪肺炎支原体(M. hyo)等病原体混合感染。同时,感染PCV2后还容易继发细菌感染,给养猪业造成巨大经济损失。近年来PCV2流行毒株由PCV2a向PCV2b,继而向PCV2d的转变,病毒的致病力逐渐变强,对养猪业的危害加重。

2015年6月,美国北卡罗来纳州某商品化猪场暴发PDNS疫情。患病母猪厌食、皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎,所产胎儿(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有相似临床症状。Palinski等借助新一代测序(NGS)技术,从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出一种新病毒,该病毒与圆环病毒科病毒具有类似基因组结构和遗传相似性,但与其他圆环病毒衣壳蛋自氨基酸序列同源性低于70%,根据国际病毒分类委员会(ICTV)圆环病毒分类标准圈,将其归类为一种新型圆环病毒,命名为PCV3。作为新动物病原体,PCV3对猪致病性和在PCVAD中作用以及现有商品化PCV2疫苗对其免疫效果等有待进一步研究。目前已有PCV3在美国、韩国、巴西、意大利、波兰以及中国的华南、华中和华北多省市流行。

自20世纪90年代以来,PCV2便一直威胁着养猪业的发展,且近年来PCV2逐渐呈现出多亚型共同流行的趋势,使PCV2防控更加困难。同时,PCV3的出现使猪圆环病毒病更加复杂化,因此及时监测两种病毒的流行变化趋势对于猪病防控尤为必要,故本发明旨在建立一种特异、快速的PCV2、PCV3二重PCR检测方法,了解PCV2、PCV3的流行情况,从而有效防控猪圆环病毒病的发生与流行,具有重要现实意义。



技术实现要素:

本发明的目的是解决上述技术问题,提供一种快速区分猪圆环病毒2型和3型的二重PCR检测引物及试剂盒,该试剂盒能够快速区分猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型,灵敏感高、特异性强,从而有效防控猪圆环病毒病的发生和流行。为实现本发明目的所使用的技术方案为:

一种快速区分猪圆环病毒2型和3型的二重PCR检测引物,所述二重PCR检测引物包括猪圆环病毒2型PCR检测引物和猪圆环病毒3型PCR检测引物;所述猪圆环病毒2型PCR检测引物由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成;所述猪圆环病毒3型PCR检测引物由具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4 所示核苷酸序列的下游引物组成。

优选的,所述猪圆环病毒2型PCR检测引物是依据猪圆环病毒2型的全基因保守区域进行设计,扩增的目的片段大小为1155 bp;所述猪圆环病毒 3型PCR检测引物是猪圆环病毒3型的全基因保守区域进行设计,扩增的目的片段大小为651 bp。

优选的,所述二重PCR检测引物在制备猪圆环病毒分型检测试剂盒的应用。

本发明还提供一种快速区分猪圆环病毒2型和3型的二重PCR检测试剂盒,包括具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游引物。

优选的,还包括2×F8 Fastlong PCR MasterMix、cDNA模板和灭菌水。

优选的,所述的二重PCR检测试剂盒中PCR反应条件为:94℃预变性2 min;94℃变性10 s,56.1℃复性10 s,72℃延伸10 s,30个循环;最后72℃延伸3 min。

优选的,所述PCR检测试剂盒的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物使用浓度为25 μmol/L。

本发明的有益效果为:

本发明提供的猪圆环病毒2型和3型的二重PCR检测试剂盒采用二重PCR扩增,两种病变相似且同为DNA病毒的病毒一次检测,检测总时间控制在2小时左右,其检测方法易于操作、方便快捷,能达到快速检测的目的。本发明能彻底解决猪圆环病毒2型和3型引起的类似症状但病原不同的诊断问题,适合猪场快速检测,亦适用于流行病学调查。

本发明提供了两对针对猪圆环病毒2型和3型的特异性引物,PCV2-P1/PCV2-P2为猪圆环病毒2型特异性扩增引物组,PCV3-P1/PCV3-P2为猪圆环病毒3型特异性扩增引物组,利用其制成的二重试剂盒能快速、特异的检测出猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型中的单一病毒以及二者的混合病毒,猪圆环病毒2型出现1155bp一个条带,猪圆环病毒3型出现651bp一个条带,猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型两种病毒混合样品出现1155bp、651bp两个条带。

本发明的猪圆环病毒2型和3型的二重PCR检测试剂盒对猪圆环病毒2型的检测极限为1.08×10-5μg/μL,表明本发明的猪圆环病毒2型和3型的二重PCR检测试剂盒在检测猪圆环病毒2型、3型时具有较高的灵敏度。常规的猪圆环病毒3型PCR检测试剂盒的灵敏度为最低能检测到0.1597ng/μL,本发明的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的灵敏度约为常规的猪圆环病毒3型PCR检测试剂盒的灵敏度14.8倍。本发明的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒既能缩短诊断时间、节约诊断试剂,又能降低使用成本。

本发明提供的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒在6个月内检测结果一致,表明本发明猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒具有很高的稳定性。田间试验证明本发明所得的猪圆环病毒2型与3型PCR鉴别诊断试剂盒实用性和适用性良好。

附图说明

图1是目的基因的PCR扩增结果,其中M:DNA分子质量标准;1:PCV2、PCV3双阳性组织样本;2:PCV2阳性组织样本;3:PCV3阳性组织样本;4:阴性对照。

图2是PCR的不同退火温度结果,其中M:DNA分子质量标准;1:50.0℃;2:50.7℃;3:51.9℃;4:53.8℃;5:56.1℃;6:58.0℃;7:59.2℃;8:60.0℃。

图3是本发明试剂盒PCR的敏感性试验结果,其中M:DNA分子质量标准;1: 1.08×10µg/μL;2:1.08×100µg/μL;3:1.08×10-1µg/μL;4:1.08×10-2µg/μL;5:1.08×10-3µg/μL;6:1.08×10-4µg/μL;7:1.08×10-5µg/μL;8:1.08×10-6µg/μL。

图4是本发明试剂盒PCR的特异性性试验结果,其中M:DNA分子质量标准;1:PCV2、PCV3双阳性组织样本;2:PCV2阳性组织样本;3:PCV3阳性组织样本;4:细小病毒;5:伪狂犬病毒;6:大肠杆菌;7:金黄色葡萄球菌; 8:副猪嗜血杆菌; 9:胸膜肺炎放线杆菌;10:阴性对照。

具体实施方式

1 材料与方法

1.1 病毒及临床样品

猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌毒株或菌株均由本实验室保存提供。临床样品采自广西各地养猪场疑似感染圆环病毒的濒死猪、病死猪或剖杀猪的主要脏器(淋巴结、脾脏、肺脏和肾脏等),剪取组织样品约0.5g~1.0g,置于灭菌研钵中,充分研磨成匀浆,加入灭菌的1mol/LPBS溶液配成1:5乳悬液,反复冻融3次。10 000 r/min离心5min,收集上清液,转入1.5mL离心管中编号供DNA抽提或者-20℃保存备用。

1.2 主要试剂

pMD18-T Vector、BamHⅠ、HindⅢ、DL2000 DNA Marker、DNA凝胶回收试剂盒(DNA Gel Extraction Kit)均为大连宝生物工程有限公司产品;2×F8 Fastlong PCR MasterMix为北京艾德莱生物科技公司产品;病毒基因组DNA/RNA快速抽提试剂盒为Axygen生物科技有限公司产品;质粒小量抽提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;E.coli DH菌种,由本实验室保存。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank上登录的PCV2和PCV3的全基因组序列,利用Meg Align(DNA Star),Primer Premier 7.0 软件针对PCV2和PCV3的全基因组保守区域分别设计一对特异性引物PCV2-P1/ PCV2-P2和PCV3-P1/PCV3-P2。PCV2上游引物PCV2-P1:5’-AATTTCCGCGGGCTGGCTG-3’,PCV2下游引物PCV2-P2:5’-CCCGCCACCGTTACCGCTG-3’,PCR扩增目的片段大小为1155bp。PCV3上游引物PCV3-P1:5’-TTTTCACTTAGAGAACGGACTTG-3’;PCV3下游引物PCV3-P2:5’-TGAGACACAGAGCTATATTCAG-3’,PCR扩增目的片段大小为651bp。引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.4病毒/细菌DNA的提取

将PRV、PPV 病毒液、大肠杆菌菌液、金黄色葡萄球菌菌液、副嗜血杆菌菌液、胸膜肺炎放线杆菌菌液及处理好的组织病料,按照AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit使用说明书进行DNA提取,所获得的DNA 用于下一步的PCR反应。

1.5聚合酶链式反应(PCR)

PCR反应体系25 µL,灭菌水7.5 µL,2×F8 Fastlong PCR MasterMix 12.5 µL,25µmol/L PCV2、PCV3上下游引物各0.5 µL,模板3.0 µL。按照下列条件进行扩增:94℃预变性2 min;94℃变性10 s,56.1℃复性10 s,72℃延伸10 s,30个循环;最后72℃延伸3 min,PCR总反应时间约为50分钟。取扩增产物10 µL于10 g/L琼脂糖凝胶中电泳,并观察结果。

1.6 特异性试验

以提取的细小病毒、伪狂犬病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌DNA以及PCV2 、PCV3、PCV2/PCV3混合阳性材料DNA为模板,用所建立的方法进行扩增,以验证该方法的特异性。

1.7 敏感性试验

1.7.1 PCV2、PCV3阳性模板的制备

将PCV2和PCV3 PCR产物进行胶回收纯化后,克隆至pMD18-T vector中,转化DH5α感受态细胞中,取100 µL菌液均匀的涂布于LA平板上,12-18 h后挑阳性菌落进LA液体培养基进行扩大培养,抽提质粒并酶切鉴定正确后,将阳性菌液送往上海生物工程有限公司测序,将测序结果放在NCBI上进行Blast确定为PCV2和PCV3特异性片段。最后,测定阳性质粒浓度,按照相应的比例将2种质粒混合,使混合后质粒浓度相同。

1.7.2 二重PCR敏感性试验

将经测定并混合后的两种质粒做连续10倍系列稀释后,将各稀释后的不同浓度的混合质粒作为PCR反应模板,在相同条件下进行PCR反应,测定所建立的二重 PCR诊断方法的敏感性。

1.8 二重PCR重复性试验

以建立的二重PCR检测方法,对PCV2和PCV3双阳性样品重复检测3次,以验证结果的可靠性。

2 结果

2.1 PCR扩增

以PCV2阳性DNA、PCV3阳性DNA、PCV2及PCV3阳性混合DNA为模板,按照1.5中的反应体系和反应程序进行二重PCR反应。电泳结果显示(见图1),所建立的二重PCR方法能够检测出PCV2阳性、PCV3阳性及PCV2和PCV3双阳性材料,扩增出PCV2目的基因约1155 bp,扩增出PCV3目的基因约651 bp,均与预期目的片段大小相符。

2.2 最佳退火温度

为获得该反应最佳扩增效果,在50-60℃的温度范围内设8个温度梯度进行二重PCR扩增,发现56.1℃时两条带最明显,确定了最佳退火温度为56.1℃(见图2)。

2.3 敏感性试验

经测定pMD18-T-PCV2和pMD18-T-PCV3质粒的浓度分别为1.8×10µg/µL和2.7×10µg/µL,将pMD18-T-PCV2和pMD18-T-PCV3质粒按照3:2进行混匀,混匀后两者的浓度均为1.08×10µg/µL。将混合后的质粒作为起始浓度进行连续10倍稀释,然后按照建立的PCR方法进行检测。结果显示,该二重PCR检测方法对PCV2、PCV3的检测极限均为1.08×10-5µg/μL(见图3)。

2.4 特异性试验结果

试验结果显示(见图4),本研究建立的PCR鉴别诊断方法能特异地检测出PCV2、PCV3或者同时检测出PCV2和PCV3,而对细小病毒、伪狂犬病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的检测结果均无条带,表明所建立的方法具有较好的特异性。

2.5二重PCR重复性试验结果

以建立的二重PCR检测方法,重复3次,结果在1155 bp处和651bp处,均得到了清晰可见的目的条带,说明建立的二重PCR检测方法具有很好的稳定性。

以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何不经过创造性劳动想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 一种快速区分猪圆环病毒2型和3型的二重PCR检测引物及试剂盒

<141> 2018-05-03

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 1

aatttccgcg ggctggctg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 2

cccgccaccg ttaccgctg 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 3

ttttcactta gagaacggac ttg 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 4

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