一株具有高效抑菌性能的枯草芽孢杆菌BYS2的制作方法

本发明涉及一株具有高效抑菌性能的枯草芽孢杆菌bys2。

发明背景

枯草芽孢杆菌能分泌如细菌素或抗菌肽等物质抑制大肠杆菌等肠道致病菌的生长，且枯草芽孢杆菌能将淀粉分解为单糖，通过肠道菌群代谢合成乳酸，降低肠道ph值，增强对肠道病原菌的抑制作用。枯草芽孢杆菌还具备生物夺氧作用，使肠道形成厌氧环境，利于厌氧有益菌(乳酸菌等)的生长，抑制致病菌的繁殖，有助于改善肠道微生态环境。枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶、蛋白酶等消化酶，提高对营养物质的消化吸收作用，提高饲料利用率，增强生长性能。

大肠杆菌病又名粘液性肠炎，是由一定血清型的致病性大肠杆菌及其毒素引起的一种暴发性肠道传染病，死亡率极高。该病以胶冻样或水样粪便为特征，可引发急性肺炎和败血症。这种病一年四季均可发生，尤其冬、春季节多发，发病率和死亡率最高，且该病愈后生长速度缓慢，由于该病易继发感染或常与其他疾病混合感染，并且容易与其他腹泻性疾病混淆，临床上很难防治。对养殖业的危害极大，造成巨大的经济损失。

现今大肠杆菌病的主要防治措施是应用抗生素。抗生素在细菌性疾病的预防及治疗方面起到关键作用，但随着抗生素的滥用，会导致畜禽产品因药物残留而使品质下降等一系列的弊端。更为严重的是，抗生素使用不当会导致细菌的耐药水平不断提高和耐药谱不断扩大，危害人类和畜禽健康。因此，探寻绿色、安全且能替代抗生素功能的产品成为国内外研究者的重要课题。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目地是提供一株具有高效抑菌能力的枯草芽孢杆菌bys2，能够耐高温、耐酸、耐胆盐，不仅能适应胃肠道内环境，而且有显著的抑制病原微生物、提高机体抗感染能力，能作为饲料添加剂使用。

一株保藏编号为cgmccno.14220具有高效抑菌能力的枯草芽孢杆菌bys2,采集于泰山土壤中，已于2017年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

所述枯草芽孢杆菌bys2的生物学特征如下：

革兰氏阳性菌，该菌单个细胞大小为0.7～0.8×2～3微米，呈杆状，无荚膜，鞭毛周生，能运动。该菌的芽孢呈椭圆形或圆柱形，于菌体中央位置或稍偏。菌落不规则，表面粗糙，有褶皱，呈白色或浅黄色，不透明，火山口状。

本发明还涉及枯草芽孢杆菌bys2作为抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌的饲料添加剂中的应用,能显著地提升动物的抗病能力；作为饲料添加剂能够抑制肠道中这些有害菌的生长，促进肠道健康。

本发明还涉及枯草芽孢杆菌bys2作为促进动物生长的饲料添加剂中的应用，能明显提高动物的体重。

本发明的有益效果：

本发明分离得到的枯草芽孢杆菌bys2可诱导机体产生抗菌肽(防御素)调节针对致病大肠杆菌的特异性免疫，杀死致病菌，保护机体，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌有强抑菌作用；作为饲料添加剂添加到饲料中，能显著地提升机体生长性能，促进有益菌生长，抑制有害菌生长，维持肠道稳态，并且能够刺激机体免疫器官的发育，提高免疫球蛋白水平，增强体液免疫功能，提高群体免疫力，进一步提高机体抗病原菌感染能力，提高养殖收益；本发明具有无残留、无毒副作用且能促进生长和提高机体免疫力等特点，能替代抗生素使用。

附图说明

图1枯草芽孢杆菌bys2分离、鉴定和筛选技术路线图；

图2枯草芽孢杆菌bys2饲喂白羽肉鸡动物试验技术路线图；

图3枯草芽孢杆菌bys2菌落形态、染色镜检结果图；

图3中：a图和b图是枯草芽孢杆菌bys2的菌落形态；c图是枯草芽孢杆菌bys2染色镜检；

图3说明：分离菌的菌落形态，表面粗糙，有褶皱，呈白色或浅黄色，火山口状，革兰氏染色为阳性杆菌,证明分离到枯草芽孢杆菌bys2；

图45株枯草芽孢杆菌bys2对产气荚膜梭菌的抑菌效果图；

图4中：1为bys2、2为bys7、3为bns12、4为bgy9、5为bm2；

图4说明：bys2(1孔)对产气荚膜梭菌的抑菌圈直径最大，表明bys2对产气荚膜梭菌的抑菌能力最强。

图55株枯草芽孢杆菌bys2对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图；

图5中：1为bys2、2为bys7、3为bns12、4为bgy9、5为bm2

图5说明：bys2(1孔)对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径最大，表明bys2对金黄色葡萄球菌的抑菌能力最强。

图65株枯草芽孢杆菌bys2对大肠杆菌的抑菌效果图；

图6中：1为bys2、2为bys7、3为bns12、4为bgy9、5为bm2

图6说明：bys2(1孔)对大肠杆菌的抑菌圈直径最大，表明bys2对大肠杆菌的抑菌能力最强。

图7枯草芽孢杆菌bys2饲喂白羽肉鸡的生长性能图；

图7说明：bys2作为饲料添加剂，在3w-5w显著提高添加组的白羽肉鸡的体重，证明本发明具有提高机体生长性能的作用，具有益生功能。

图8枯草芽孢杆菌bys2添加饲料后进行致病性大肠杆菌攻毒，白羽肉鸡的存活率图；

图8说明：bys2作为饲料添加剂，提高了机体大肠杆菌感染的存活率，证明本发明具有提高机体抗病力的作用，具有益生功能。

具体实施方式

1.泰山枯草芽孢杆菌的获得

(1)培养基组分

①营养肉汤培养基(g/l)：蛋白胨10.0、牛肉浸出粉3.0、氯化钠5.0，ph值7.2。

②营养琼脂培养基(g/l)：蛋白胨10.0、牛肉浸出粉3.0、氯化钠5.0、琼脂15.0，ph值7.3。

③伊红美蓝培养基(g/l)：蛋白胨10.0、乳糖10.0、磷酸氢二钾2.0、琼脂15.0、伊红0.4、美蓝0.065，ph值7.0。

(2)菌株的分离：分别在泰山四个不同地点取土壤表层10cm以下的土壤100g，将采得的土壤放入无菌灭菌袋中带回实验室分离。每个点土层的土壤分别称取10g放入含有100ml无菌去离子水的锥形瓶中，摇动15min，80℃水浴1h，再加入7g的nacl，80℃水浴1h。静止10min，于超净台中分别吸取上层液0.5ml加入到含有4.5ml无菌去离子水的试管中，混匀后制成10^-1的悬液，然后将悬液用磷酸盐缓冲液稀释到10^-2、10^-3、10^-4，分别取不同稀释度100μl的悬液滴到营养琼脂培养基平板上，用涂布器涂匀，并将营养琼脂培养基倒置于37℃恒温培养12h。

(3)菌株的筛选：用接种环取单菌落于营养琼脂培养基中划线纯化，37℃培养12h，经菌落形态观察、革兰氏染色镜检以及生化实验，最终分离得到5株枯草芽孢杆菌(菌落不规则，表面粗糙，有褶皱，呈白色或浅黄色，不透明，火山口状；革兰氏阳性菌，呈杆状)，分别命名为bys2、bys7、bns12、bgy9、bm2(其中：bys2、bys7从同一个地点分离，bns12、bgy9、bm2从其他三个地点分离)。

2.泰山枯草芽孢杆菌的鉴定

将步骤1初选到的5株枯草芽孢杆菌分别进行如下鉴定：

(1)将枯草芽孢杆菌在营养琼脂平板上37℃培养12h后，经光学显微镜观察革兰氏染色及细菌形态。

(2)16srdna序列的pcr扩增引物设计：

27f-agagtttgatcctggctcag(seqidno:1)

1492r-acggctaccttgttacgactt(seqidno:2)

(3)pcr反应体系:10×pcr缓冲液(含20mmol/l的mg²⁺)2μl，20μmol/ldntp1.6μl，0.1od/ml引物(27f,1492r)各0.4μl，5u/μltaq酶0.2μl，ddh2o14.4μl，总dna模板1μl。

反应条件:94℃变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后，取10μlpcr产物于1％琼脂凝胶中电泳，pcr产物经回收纯化后由北京擎科新业生物技术有限公司完成测序，通过ncbi数据库比对序列。

3.人工胃液、肠液和胆盐耐受性测定

5株分离得到的枯草芽孢杆菌均分别接种于装有10ml营养肉汤培养基的离心管中，37℃震荡培养12h(180r/min)。分别取每株枯草芽孢杆菌培养物3000r/min离心10min，弃去上清，用磷酸盐缓冲液洗两遍。接种到两支装有营养肉汤培养基的试管使菌液浓度为10⁶cfu/ml。

一个试管用盐酸溶液调整ph为2.5，加入胃蛋白酶使其终浓度为1％，模拟人工胃液。另一个试管调整ph为7.2，加入胰蛋白酶使其终浓度为1％，模拟人工肠液。两个试管于37℃震荡培养，1h和2h后分别取100μl培养物，10倍倍比稀释后涂到营养琼脂培养基上进行细菌计数。

分别将5株分离得到的枯草芽孢杆菌接种于装有10ml的营养肉汤培养基的试管中，37℃震荡培养12h(180r/min)。配制营养肉汤培养基100ml，加入0.3％(质量比)胆盐。取每株枯草芽孢杆菌培养物以体积比1％的接种量接种到含0.3％的胆盐营养肉汤培养基中，37℃震荡培养6h，观察细菌的生长情况，测od600，计算存活率。

表1枯草芽孢杆菌在人工胃液、肠液和胆汁中的存活率(％)

由表1综合比较可得出，bys2、bys7对人工胃肠液的耐受能力较强，高于其他分离株。

蛋白酶活性测定

分别将分离得到的5株枯草芽孢杆菌接种于5ml营养肉汤培养基中，37℃振荡培养12h(180r/min)，取上述枯草芽孢杆菌培养物于5ml离心管中，6000r/min离心15min，取上清液体根据sb/t10317-1999蛋白酶活力测定法测定蛋白酶活力。

表2蛋白酶活性测定

由表2可以看出，bys2产蛋白酶的能力高于其他4株枯草芽孢杆菌。

5.抑菌能力的测定

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种到营养肉汤培养基中37℃培养12h，产气荚膜梭菌于硫乙醇酸盐流体培养基37℃厌氧培养16h。分别挑取5株分离得到的泰山枯草芽孢杆菌接种于5ml营养肉汤培养基中37℃培养12h。分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌菌液进行稀释，使菌液的终浓度为10⁶cfu/ml，各取100μl均匀涂布于营养琼脂培养基平板上，用直径为5mm的打孔器打孔，取40μl枯草芽孢杆菌液加到孔中。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌37℃有氧培养，产气荚膜梭菌厌氧培养12h后测量枯草芽孢杆菌对病原菌的抑菌直径。

表3菌株的抑菌能力比较(单位：mm)

表3表明所分离得到的5株枯草芽孢杆菌均对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌有抑菌效果，其中bys2株对三种致病菌的抑菌效果均高于其他4株枯草芽孢杆菌。

综合对人工胃肠液耐受性、产酶能力以及对致病菌的抑菌能力，最终将bys2确定为最优菌株，命名为枯草芽孢杆菌bys2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14220。枯草芽孢杆菌bys2能够耐高温、耐酸、耐胆盐，不仅能适应胃肠道内环境，而且有显著的抑制病原微生物、提高机体抗感染能力。

6.安全性试验

小鼠通过饮水直接添加枯草芽孢杆菌bys2，每次每只小鼠添加1ml的10⁹cfu/ml枯草芽孢杆菌，每天饲喂1次，连续饮用3天，饮用含有枯草芽孢杆菌饮水的小鼠全身状况正常，没有观察到中毒现象或死亡。说明该枯草芽孢杆菌bys2使用后无毒副作用，可用作动物的微生态制剂。

7.饲喂枯草芽孢杆菌的白羽肉鸡实验

健康且体重相近(50±1g)的白羽肉鸡(120只)随机分成两个处理组(枯草芽孢杆菌bys2饲喂组或对照组)，每组3个重复(每个重复20只)，全部放置于隔离器中。所有肉鸡均提供足够的饲料及饮水，并根据相应的生物安全规则进行处理。所有实验方案均经山东农业大学动物关爱和使用动物委员会批准。实验持续42天(d),分别在3周(w)、4周、5周时测定肉鸡的个体体重，验证饲喂枯草芽孢杆菌对机体生长性能的影响。

在饲喂5周后从每个重复组随机挑选4只肉鸡进行腹腔内大肠杆菌o1k1的攻毒试验，攻毒剂量为1ml的10⁸cfu/ml的大肠杆菌。统计肉鸡存活率，验证饲喂枯草芽孢杆菌对机体抗病力的影响。

结果表明，实验所使用的枯草芽孢杆菌bys2具有显著的促生长性能，分别在3w-5w时均能明显提高实验组白羽肉鸡的体重，其与对照组存在显著性的差异(p＜0.05，图6)。说明枯草芽孢杆菌bys2作为饲料添加剂添加到饲料中，能显著地提升白羽鸡肉机体生长性能，提高养殖收益。

结果还表明，饲喂枯草芽孢杆菌bys2能显著地提升白羽肉鸡的抗病能力(p<0.05，图7)，提高机体抗致病菌感染的存活率，提高养殖收益。

序列表

<110>山东农业大学

<120>一株具有高效抑菌性能的枯草芽孢杆菌bys2

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<212>dna

<213>27f(人工序列)

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<212>dna

<213>1492r(人工序列)

<400>2

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