一种金黄杆菌属菌株及其应用的制作方法

本发明涉及一种金黄杆菌属菌株及其应用，特别是一种用于解离煤矸石释放钾、磷、硅、钙和/或硫的金黄杆菌属菌株。

背景技术：

我国是以煤炭为主要能源的国家，煤炭资源丰富、分布广泛、品种齐全，煤炭对我国经济发展起到举足轻重的作用。煤矸石是在煤炭开采及洗选过程中产生的一种炭含量低，比煤坚硬的固体废弃物，约占原煤炭产量的15％-20％。历年来国内各产煤区估计有数十亿吨煤矸石废弃，多以露天形式堆积，形成无数个煤矸石山，至今未得到有效利用。

露天堆放的煤矸石，经雨水冲淋后，其中有害物质会被逐渐溶解，并随雨水流进土壤、地表水体或地下水体，造成严重的污染。污染的地下水被人们饮用后，人体的健康会受到其中有害物质的严重威胁，甚至危及生命。被污染的地表水水体中的水质会逐渐酸化，当用来养殖或浇灌植物时，会对畜牧业和植被造成不可逆的损害。同时当淋溶水随雨水流进土壤时，会破坏土壤的养分，影响土壤中微生物的代谢活动，阻碍了植物根系的发育和生长。

煤矸石中含有丰富的营养元素，有很多成份是植物生长所必需的。通过微生物细菌解离煤矸石的方法，是一种工艺简单可靠的、低成本的、绿色利用煤矸石的新方法。通过微生物细菌解离煤矸石，释放其中植物可利用的营养成分，创制以煤矸石为基本原料的微生物复合肥料，是煤矸石综合利用的新途径。

由于多种原因，煤矸石未得到有效利用，造成资源的闲置和对环境的巨大污染，开发煤矸石的新用途，保护环境生态，具有重要的现实意义。

由此可见，本领域有待进一步地发掘出更多的新菌株应用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种金黄杆菌属菌株及其应用。本发明从煤矸石中分离纯化出金黄杆菌属菌株(chryseobacteriumsp)gzu-ch01，该菌株是一株新的、且可以有效地分解煤矸石中的不溶性的钾、磷、硅、钙、硫等成分，变成速效钾、有效磷、有效硅、交换性钙、有效硫等作为植物吸收的营养物质成分的菌株。特别是gzu-ch01能有效地解离煤矸石中的不溶性钾，使其成为速效钾，提供了宝贵的钾资源来源，同时gzu-ch01对其它含钾矿物也有良好的解离作用，可在煤矸石中参杂其它含钾矿物如钾长石，可进一步提升以煤矸石为基本原料的矿物微生物复合肥中的钾含量。且本发明gzu-ch01菌株解钾效果优于传统巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)和硅酸盐细菌(silicatebacteria)。

本发明的技术方案：一种金黄杆菌属菌株，所述菌株为金黄杆菌属；所述菌株命名为金黄杆菌属gzu-ch01，于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：m2017810。

用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的制品，所述制品的活性成分包括前述的金黄杆菌属gzu-ch01。

用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的制品，所述制品的活性成分是前述的金黄杆菌属gzu-ch01。

一种解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的制品的制备方法，采用前述的金黄杆菌属gzu-ch01作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。

一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的方法，在解离的过程中添加和/或使用前述的制品。

一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的菌剂，所述菌剂的活性成分包括前述的金黄杆菌属gzu-ch01。

一种用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的菌剂菌剂，所述菌剂的活性成分是前述的金黄杆菌属gzu-ch01。

前述的用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和/或硫的菌剂菌剂，还包括用于制备菌剂的常规成分。

一种前述的金黄杆菌属菌株的应用，用于解离煤矸石中的钾、磷、硅、钙和硫。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、从完全风化的煤矸石中分离、筛选、提纯，获得高效分解煤矸石中钾的菌株。此方法获得的菌株针对性强，解离效果好，能有效地解离煤矸石中的多种成分，特别是对煤矸石中难溶钾的解离，具有良好的效果。利用gzu-ch01菌株使得煤矸石创制微生物复合肥料成为可能。

2、煤矸石资源化的开发利用，能缓解煤矸石带来的环境危害，创制的微生物复合肥料可以缓解土壤中缺钾的问题，而且还可以避免长期使用化肥带来的环境问题如土壤板结等，与目前应用化学方法处理煤矸石相比，对环境更友好。

综上所述，本发明从废弃的煤矸石中分离，筛选，提纯，获得高效分解煤矸石中钾和磷的菌株。此方法不仅可以有效处理废弃的煤矸石，缓解煤矸石带来的环境危害，而且还可以让煤矸石变废为宝，成为能再利用的有效资源。如果将煤矸石创制的微生物矿物复合肥料施于土壤，不仅可以缓解土壤中缺钾问题，还可以避免大量化肥使用带来的如土壤板结、磷素固化等环境问题，更好地促进磷钾资源的利用。

附图说明

图1是本发明gzu-ch01菌株生长曲线；

图2是本发明gzu-ch01菌株菌落外观图；

图3是本发明gzu-ch01菌体形态图；

图4是gzu-ch01菌株基于部分16srrna基因序列建立的系统进化树。

具体实施方式

实施例：

金黄杆菌属gzu-ch01的分离，包括以下步骤：

1.功能菌株gzu-ch01菌株的分离与筛选

1)样品的采集

(1)样品采自于某煤炭产区煤矸石山，选择完全风化的煤矸石，将采集的样品装入采集袋；

(2)将采集的样品破碎、筛分，收集过100目的样品；

(3)将样品保存于4℃冰箱中备用；

(4)煤矸石样品的成分为：c8.24％，sio240.56％，al2o319.46％，fe2o315.12％,tio24.61％，cao3.32％，mgo2.5％，k2o1.66％，na2o0.6％，p2o51.42％，s1.07％，h0.88％，n0.54％，灰分82.81％。

2)功能菌株的筛选

(1)准确称取1g样品于灭菌的250ml的锥形瓶中，加入99ml无菌水；

(2)然后在170r/min，30℃的恒温摇床中振荡30min；

(3)对照组是加入100ml无菌水于250ml锥形瓶中；

(4)振荡30min以后，取上清液逐级稀释至10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7；

(5)每种浓度分别取100ul涂布于3个解钾细菌筛选固体培养基上，空白为涂布无菌水的平板；

(6)将平板放于30℃的恒温培养箱中培养3～4天；

(7)将外观特征不同的单菌落划线接种于解钾细菌筛选固体培养上；

(8)待菌株长出后，通过初步外观形态观察以及显微形态观察，观察菌株纯化情况，没有达到纯化要求，则多次重复进行，直到获得单一菌株，同时区别出不同的菌株；

(9)将纯化的菌株，进行革兰氏染色；

(10)对初筛的已纯化的菌株进行培养，解离煤矸石，通过测定其中的速效钾含量，确认菌株的解钾效果，筛选出解钾效果好的菌株。

2.功能菌株的生长曲线的绘制

1)种子液的制备。取该菌株用接种环接种于lb液体培养基中，在30℃条件下，培养至对数期。

2)接种。取上述种子液的10ml接种于装有200ml的液体lb培养基中，混匀后分别取5ml混合液分别装于上有标记的18支无菌试管中。

3)培养。将已接种的试管置30℃，170r/min的摇床中培养，分别培养相应的时间取出。

4)测量。用未接种的lb液体培养基做空白，在600nm波长下与待测样一起进行光电比浊。

测定结果如图1，从图中可知，0-10h为延滞期，10-15h为对数期，15h-25h为稳定期，25h以后为衰亡期。

3.功能菌株的鉴定

1)菌落外观形态

如图2，从图中可知该菌株在lb固体培养基上的菌落外观形态：深黄色，不透明圆形，菌落隆起，边缘整齐，有光泽，表面光滑湿润，质地粘稠，其大小约为1mm。

2)革兰氏染色，菌体形态

如图3，从图中可知该菌株为革兰氏阴性杆菌，单个菌体分散存在，无芽孢和荚膜。

3)菌株鉴定

(1)细菌dna的提取

挑取纯化的菌株的单菌落至装有lb液体培养基的锥形瓶中进行培养，得到纯菌种发酵液后，以细菌基因组提取试剂盒(离心柱型，天根生化科技北京有限公司)提取dna，以其作为模版进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)，使用taqdna聚合物扩增16srrna，用2f(5′-agagtttgatcctggctcaggatga-3′)，1492r(5′-tacggctaccttgttacgacttagc-3′)的通用引物进行扩增，pcr扩增反应体系和扩增反应条件如表1所示。

以1×tbe缓冲液配制1.0％琼脂糖凝胶，加入40μlpcr扩增产物，加8μl2000bpdnamarker，在电压110v，电流70ma，电泳45min，观察凝胶成像结果。

(2)同源性比对

将聚合酶链式反应扩增产物经凝胶回收试剂盒纯化，送交测序公司(上海立菲生物技术有限公司)测序，将测得的序列在ncbi(美国国立生物技术信息中心)上利用standardnucleotideblast进行比对，并利用clustalw、mega5.05等软件基于邻接法(neighborjoiningmethod)进行系统发育分析，构建系统发育树(图4)，以获得菌种的分类信息。从图中可知，gzu-ch01细菌与金黄杆菌属chryseobacteriumsp.india-r31(kf751764.1)，聚在同一个分支上，结合生理生化特性和形态观察，序列同源性达99％，gzu-ch01鉴定为金黄杆菌属。

(3)生理生化实验

通过一系列生化实验，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，1999)，经鉴定该菌株为金黄杆菌属。

4.菌株对煤矸石的解离能力的测定

1)所用煤矸石主要成份为：c11.05％，sio235.44％，al2o317.26％，fe2o318.11％,tio23.22％，cao4.48％，mgo2.52％，k2o2.04％，na2o1.73％，p2o51.62％，s1.05％，h0.79％，n0.66％，灰分79.63％

2)影响煤矸石解离的四个主要因素为：解菌量，体系的培养时间，粒径大小，体系ph值。先进行gzu-ch01、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌单因素实验，分别寻找各菌的最佳单因素条件，再通过设计正交实验寻找gzu-ch01、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌最佳解离煤矸石条件。

3)针对成分为1)煤矸石，用gzu-ch01、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌进行解离比较实验。

4)解离实验过程如下：取已破碎过指定目数的煤矸石，于控温搅拌器中，gzu-ch01、巨大芽孢杆菌、硅酸盐细菌菌液浓度控制在：5.5×10¹⁶-6.0×10¹⁶cfu/ml，三株细菌与煤矸石的用量比例为1:1,在连续搅拌下，喷撒菌液，搅拌均匀，每间隔2-3小时翻动一次，温度控制在不高于30℃，解离煤矸石数天。

5)测定解离后煤矸石各指标含量，结果如表2。从表2中可以看出，gzu-ch01解离煤矸石的总体效果优于巨大芽孢杆菌和硅酸盐细菌，主要指标速效钾、有效磷、碱解氮均优于巨大芽孢杆菌和硅酸盐细菌，特别是解钾效果较巨大芽孢杆菌和硅酸盐细菌有大的提升。

表1.pcr扩增反应体系和扩增反应条件

表2正交设计实验结果

序列表

<110>贵州大学

<120>一种金黄杆菌属菌株及其应用

<130>2017

<141>2019-01-31

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1394

<212>dna

<213>金黄杆菌属(chryseobacteriumsp)

<400>1

cacatgcaagccgagcggtatttgtctttcgggacagagagagcggcgtacgggtgcgta60

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