一种检测鸭疫里默氏菌的荧光定量PCR引物组及其检测方法与流程

本发明涉及兽医微生物分子检测技术领域，更具体的涉及一种检测鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr方法及应用。

背景技术：

鸭传染性浆膜炎又名鸭疫里默氏病，是侵害鸭的一种急性败血性传染病，以全身浆膜面发生纤维素性炎症为特征，其发病率和死亡率均很高，急性病变多以死亡为转归，慢性病多会耐过，但会失去经济价值，已成为危害养鸭业的一种重要传染病。

目前，鸭疫里默氏菌病的临床诊断主要的方法是血清学诊断(酶联免疫吸附实验和间接免疫荧光试验)和常规pcr检测等。由于鸭疫里默氏菌血清学众多，目前已报道的有21中血清型，检测难度较大；常规pcr检测技术虽然较为常用，但灵敏性低于荧光定量pcr，易出现漏检的现象，而且只能定性，不能定量。sybrgreeni实时荧光pcr使用一对特异性引物和sybrgreeni核酸染料，利用荧光信号积累实时监测整个pcr过程，无需电泳，以其速度快、灵敏度高、特异性强、自动化程度高、能定量等优点而被广泛应用于病原体检测。但目前缺乏特异性检测鸭疫里默氏菌的实时荧光定量pcr引物及检测方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种检测鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr方法，根据鸭疫里默氏菌16srrna保守序列设计特异性引物，经优化反应体系和条件，建立了检测鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr方法，该方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点，可用于临床鸭传染性浆膜炎疑似病例样本的辅助诊断和检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

检测鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr方法，具体包括以下步骤：

(1)以鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的16srrna为检测靶基因，设计特异性引物对，目标产物长度为163bp；

(2)提取鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的总rna，反转录为cdna。

(3)以步骤2中的cdna为模板，以步骤1中引物对为引物，进行普通pcr扩增目的片段，产物纯化后构建重组质粒，并测序验证；

(4)步骤(3)中测序验证正确的重组质粒进行浓度测定，10倍梯度稀释为不同浓度作标准品，-20℃保存备用；

(5)以步骤(4)中的10倍梯度稀释的标准品质粒为模板，sybrgreen染料法进行荧光定量pcr反应，建立起始模板拷贝数的对数与阈值循环数之间的标准曲线和标准方程；

(6)将待测样品进行rna提取和反转录为cdna，然后使用步骤(1)中的引物对待测样品进行检测，将所测得的阈值循环数根据标准曲线即可计算出待测样品中鸭疫里默氏菌的拷贝数，即为待测样品中鸭疫里默氏菌的含量。

进一步的，上述步骤(1)中，设计的特异性引物序列，上游引物：5’-actgccgttgatactgcta-3’，如seqidno:1所示；下游引物：5’-tctaatcctgttcgctccc-3’，如seqidno:2所示；扩增目的片段为163bp，其核苷酸序列为：

actgccgttgatactgctagtcttgagtatagttgaggtagctggaatgagtagtgtagcggtgaaatgcatagatattactcagaacaccgattgcgaaggcaggttaccaagttataactgacgctgagggacgaaagcgtggggagcgaacaggattaga,如seqidno.3所示。

进一步地，在上述步骤(3)中，重组质粒的构建步骤为：

a.将pcr产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳；

b.跑胶结束，紫外灯下观察，将含目的片段的凝胶进行切胶回收；

c.胶回收试剂盒进行pcr胶回收和纯化；

d.连接：pcr纯化产物与pmd-18t载体连接，其反应体系为：pcr纯化产物7μl，pgm-t载体1μl，t4连接酶1μl，10×ligationmix1μl。16℃水浴连接过夜；

e.转化：将10μl连接产物加入dh5α细胞中，轻轻混匀放置10min，42℃热击90s，冰上放置2min后移入加有1ml无抗生素lb的1.5ml离心管中，置于37℃摇床中180rpm/min摇菌45min；

f.涂板：取上述步骤f中的转化菌液100μl加入到含双抗的lb平板中，用三角棒涂抹均匀，置于37℃生化培养箱中过夜培养；

g.阳性质粒鉴定：挑取步骤g过夜培养后的lb板中的菌落5个，进行菌落pcr鉴定，pcr鉴定阳性的菌液送生工生物公司测序，测序序列正确的为阳性质粒菌；

h.阳性质粒的提取：测序正确的阳性质粒菌进行扩大培养后，质粒提取试剂盒提取质粒，测定质粒浓度。

进一步的，上述步骤(4)中重组质粒浓度为56ng/μl，每μl质粒拷贝数按公式(质粒浓度ng/μl×10^-9×6.02×10²³)/(质粒dna长度×660)转化为拷贝数，即(56×10^-9×6.02×10²³)/(163+2692)×660＝1.789×10⁹拷贝/μl。

进一步的，上述步骤(5)中，荧光定量pcr反应体系为：2×superrealpremix10μl，50×roxreferencedye0.4μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl，cdna模板2μl，ddh2o7.0μl。

进一步的，上述步骤(5)中，荧光定量pcr的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性25s，62℃退火25s，72℃延伸30s，40个循环，在每次62℃结束时收集荧光信号；95℃30s，62℃退火30s，95℃30s，收集溶解曲线。

进一步的，上述步骤(5)中标准曲线的建立方法为：

以8个稀释浓度的标准品质粒dna为模板，浓度分别为1.789×10¹-1.789×10⁸拷贝/μl，用荧光定量pcr方法进行检测，利用荧光定量pcr仪自带的数据分析软件分析，建立起始模板拷贝数(x)的对数与ct值(y)之间的标准曲线和标准方程。

经数据经数据分析软件分析，以纵坐标(y)代表ct值，横坐标(x)代表起始模板拷贝数，得到标准曲线方程为y＝-3.319*log(x)+33.83，eff.(扩增效率)和rsq(相关系数方值)分别为100.1％和0.997，各标准品的浓度对数与其ct值之间均呈良好的线性关系。

由上述技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种检测鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr方法，该方法标准曲线线性关系良好，每反应2μl质粒标准品，定量范围为1.789×2×10¹-1.789×2×10⁸拷贝/反应，即3.578×10¹-3.578×10⁸拷贝/反应，最低检测限达35.78拷贝/反应，与常见的沙门氏菌和大肠杆菌无交叉反应，重复试验的变异系数为0.65％-1.9％。

本发明还提供了一种基于鸭组织进行鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr方法，包括以下步骤：

(a)取鸭组织样品约50mg放入灭菌匀浆管中，加入trnzol，置于匀浆器中匀浆，按trnzol试剂说明书的方法提取总rna；

(b)用fastking一步法除基因组cdna第一链合成预混试剂将步骤(a)中总rna反转录为cdna；

(c)将步骤(b)得到的cdna作为模板，按照上述步骤(3)-(6)进行鸭传染性浆膜炎鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr方法进行检测。

本发明的有益效果在于：

1.本发明选择鸭疫里默氏菌16srrna基因的一段特异性区域作为靶序列，设计了2条特异性引物，扩增的目标片段长163bp，该pcr引物具有特异性强、敏感性高的优势。

2.本发明还提供了鸭疫里默氏菌检测用的重组质粒，该质粒经dna浓度测定，浓度为56ng/μl，该质粒可用于鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌检测的标准质粒。

3.本发明还提供了上述标准质粒荧光定量pcr的标准曲线、标准方程、扩增曲线及溶解曲线。

4.本发明还提供了一种鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌中的应用，可用于疑似鸭疫里默氏菌病鸭的定量检测。

即本发明提供的一种检测鸭传染性浆膜炎病鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点，可用于临床对鸭疫里默氏菌的检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中16srrna基因的pcr扩增及鸭疫pgm-18t-16srrna-163质粒的pcr鉴定结果。(a)m：dl2000marker，1：鸭疫里默氏菌的pcr产物，3：ddh2o。(b)m：dl2000marker，1-6：重组菌pcr扩增产物，7：ddh2o。

图2为本发明实施例1中标准品鸭疫pgm-18t-16srrna-163质粒(1.789×10¹-1.789×10⁸拷贝/μl)荧光定量pcr扩增曲线。

图3为本发明实施例1中荧光定量pcr检测鸭疫pgm-18t-16srrna-163质粒的溶解曲线。

图4为发明实施例1中荧光定量pcr检测鸭疫pgm-18t-16srrna-163质粒的标准曲线。

图5为发明实施例2中荧光定量pcr检测鸭组织中鸭疫里默氏菌16srrna-163的扩增曲线。

图6为本发明实施例3中荧光定量pcr检测组织中鸭疫里默氏菌16srrna-163的检测结果。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清除、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中，所用材料与试剂为：

鸭疫里默氏菌标准菌株atcc11845，大肠杆菌标准菌株cmcc44102，沙门氏菌标准菌株50336为本实验保存菌株。trizol总rna提取试剂，fastking一步法除基因组cdna第一链合成预混试剂，superrealpremixplus(sybrgreen)荧光定量检测试剂盒，pmd-18t克隆试剂盒，小量质粒提取试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒，dh5a感受态，氨苄青霉素，琼脂糖等均购自天跟生物(北京)科技有限公司。

实施例1.检测鸭传染性浆膜炎鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr方法的建立：1.引物设计与合成

以鸭的16srrna为检测靶基因，用primerpremier5.0软件设计特异性引物，引物序列为：

上游引物：5’-actgccgttgatactgcta-3’；

下游引物：5’-tctaatcctgttcgctccc-3’。

2.rna的提取和反转录为cdna

取冻融的菌株划线接种于tsa培养板中，37℃生化培养箱内培养18-24h后挑选单菌落接种于tsb培养基中，37℃摇床内继续培养18-24h，取菌液5ml，10000r/min离心1min，弃上清液，收集菌体，加入trizol试剂，提取试剂说明书提取总rna，再按照fastking一步法除基因组cdna第一链合成预混试剂说明书将rna反转录为cdna。

3.重组质粒标准品的制备及检验

以上述获得的cdna为模板，用设计的引物进行特异性目的片段的扩增，经凝胶电泳，条带大小与预期一致，如图1。用琼脂糖凝胶回收试剂盒按照说明书纯化回收相应的目的片段，然后按pgm-18t克隆试剂盒说明书将回收的目的片段与pgm-18t载体连接，连接产物转化dh5α感受态细胞，通过菌落pcr筛选阳性克隆，可扩增出163bp目的片段的菌液为含阳性克隆质粒菌，见图1，将阳性克隆菌送英骏生物公司测序鉴定；经测序鉴定，证实目的片段已正确连接入pgm-18t载体，且所得目的片段序列与genbank上公布的鸭疫里默氏菌16srrna基因序列同源性为100％。取测序结果正确的阳性克隆菌液5ml，按照质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒，命名为鸭疫pgm-18t-16srrna-163。提取阳性克隆菌质粒，经分光光度计测定质粒浓度为56ng/μl，每μl质粒拷贝数按公式(质粒浓度ng/μl×10^-9×6.02×10²³)/(质粒dna长度×660)转化为拷贝数，即(56×10^-9×6.02×10²³)/(163+2692)×660＝1.789×10⁹拷贝/μl，即所得的鸭疫pgm-18t-16srrna-163质粒dna的浓度为1.789×10⁹拷贝/μl，能满足标准品的要求。将获得的质粒原液进行10倍梯度稀释，分别为1.789×10¹-1.789×10⁸拷贝/μl做标准品，-20℃保存备用。

4.荧光定量pcr反应

(1)荧光定量pcr反应条件的优化

取中间浓度1.789×10⁵拷贝/μl的标准品dna为模板，温度在60℃±2℃范围内，引物终浓度在0.6-1.0μmol/l进行荧光定量pcr扩增，以获得最低的ct值和较高的相对荧光强度增加值(δrn)时的退火温度为最佳。最终确定荧光定量pcr反应20μl体系为：2×superrealpremix10μl，50×roxreferencedye0.4μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl，cdna模板2μl，ddh2o7.0μl。荧光定量pcr的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性25s，62℃退火25s，72℃延伸30s，40个循环，在每次62℃结束时收集荧光信号；95℃30s，62℃退火30s，95℃30s，收集溶解曲线。

(2)标准曲线的建立

以8个梯度(1.789×10¹-1.789×10⁸拷贝/μl)的标准品dna为模板，用优化后的荧光定量pcr方法进行检测；利用仪器自带的数据分析软件分析，建立ct值(x)与相对荧光强度增加值之间的扩增曲线，如图2；建立起始模板拷贝数(x)的对数与ct值(y)之间的标准曲线和标准方程，如图3；以及熔解温度与荧光强度之间的熔解曲线，如图4。

经数据分析软件分析，以纵坐标(y)代表ct值，横坐标(x)代表起始模板拷贝数，得到标准曲线方程为y＝-3.319*log(x)+33.83，eff.(扩增效率)和rsq(相关系数方值)分别为100.1％和0.997，各标准品的浓度对数与其ct值之间均呈良好的线性关系。

3.敏感性分析：经数据软件分析，上述荧光定量pcr获得的扩增曲线在8个梯度的标准品之间的间隔均匀，如图2所示。说明在1.789×10¹-1.789×10⁸之间的扩增效率一致；获得的熔解曲线峰为单一的峰，说明引物的特异性较强，如图3所示。

以8个梯度(1.789×10¹-1.789×10⁸拷贝/μl)的标准品dna为模板，用优化后的荧光定量pcr方法进行检测；利用仪器自带的数据分析软件分析，建立起始模板拷贝数(x)的对数与ct值(y)之间的标准曲线和标准方程，并根据各标准品dna的扩增结果来判断该方法的定量范围和敏感性。试验结果如图2(标准品出拷贝/μl荧光定量pcr扩增曲线)和图3(荧光定量pcr检测鸭疫里默氏菌16srrna的标准曲线)所示。

由图2可知，用优化建立的荧光定量pcr方法对，8个梯度(1.789×10¹-1.789×10⁸拷贝/μl的标准品dna进行扩增，结果显示：标准品在1.789×10²-1.789×10⁸拷贝/μl的扩增曲线均呈现明显的“s”型，低浓度标准品1.789×10¹拷贝/μl)的扩增曲线因未达扩增平台期虽不呈现“s”型但较陡，各梯度标准品扩增曲线荧光增量均明显、间距均匀；空白对照和阴性对照均没有出现扩增。

标准品dna为1.789×10¹拷贝/μl时，3个重复的ct值分别为34.05，34.30，34.41，标准品为1.789×10⁸拷贝/μl时，3个重复的ct值分别为10.39，10.52，10.45。且仍有明显的扩增曲线，因此，检测范围为1.789×10¹-1.789×10⁸拷贝/μl；由于荧光定量cdna加样量为2μl/反应，因此，该方法的灵敏度为35.78拷贝/反应。为保证检测结果的准确性，本标准品在实际检测中以ct值35为界限，若检测样品的ct值小于或等于35，且有扩增曲线，则检测样品判为阳性；ct值大于35，且有扩增曲线，则重复一次，如结果一致，判为阳性；ct值大于35，重复结果未出现扩增曲线，判为阴性。

由图4可知，经数据分析软件分析，以纵坐标(y)代表ct值，横坐标(x)代表起始模板拷贝数，得到标准曲线方程为y＝-3.319*log(x)+33.83，eff.(扩增效率)和rsq(相关系数方值)分别为100.1％和0.997，各标准品的浓度对数与其ct值之间均呈良好的线性关系。

以上结果表明，本发明所构建的荧光定量pcr反应体系对标准品的扩增效率高，建立的标准曲线能够准确地反映目的产物的扩增，可用于定量分析。

实施例2.鸭传染性浆膜炎鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr检测方法的特异性试验

以沙门氏菌、大肠杆菌的cdna样品为模板，用优化建立的荧光定量pcr方法进行检测，评价方法的特异性，试验结果如图5所示。

其中，沙门氏菌和大肠杆菌的复苏，rna提取和反转录方法为：分别取冻融的沙门氏菌和大肠杆菌菌株划线接种于ss平板(沙门氏菌)和lb平板上，37℃生化培养箱中培养18-24h后挑选单菌落接种于lb培养基中，37℃继续培养18-24h。取上述菌液5ml，10000r/min离心1min，弃上清液，收集菌体，按trizol试剂说明书提取rna，用fastking一步法除基因组cdna第一链合成预混试剂说明书将rna反转录为cdna。

由图5可知，只有鸭疫里默氏菌出现扩增曲线，而其他病原及阴性、空白对照均未出现扩增曲线。

以上试验说明，本发明建立的荧光定量pcr对鸭疫里默氏菌16srrna的检测具有很强的特异性。

实施例3.鸭传染性浆膜炎鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr检测方法的重复性试验

以10⁶、10⁵、10⁴、10³拷贝/μl4个梯度的标准品dna为模板，每个浓度3次重复，同时进行荧光定量pcr检测，计算每个浓度重复实验ct值的变异系数。试验结果如表1(鸭疫16srrna-163荧光定量pcr重复试验结果)所示。

表1鸭疫16srrna-163荧光定量pcr重复试验结果

由表1可知，10⁶、10⁵、10⁴、10³拷贝/μl3组标准品dna荧光定量pcr重复性试验ct值的变异系数(cv)分别为0.65％、1.90％、0.99％、1.00％，均小于2％，符合重复性的要求。以上试验说明，本发明建立的荧光定量pcr方法具有较好的重复性。

实施例4.鸭传染性浆膜炎鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr检测方法的应用

将建立的鸭传染性浆膜炎鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr检测方法用于疑似感染鸭疫里默氏菌鸭的心，肝，脾，肺，脑组织中鸭疫里默氏菌的检测，取50mg组织样品进行rna提取，反转录为cdna，再通过建立的荧光定量pcr方法进行检测，结果在共计150份样品中检测出92份阳性，ct值介于22.0-35.0之间，结果见图6，且均在标准曲线上，获得的标准曲线方程为y＝-3.4321log(x)+31.95，eff＝95.6％，rsq：0.999，经计算样品中鸭疫里默氏菌的拷贝数介于2.32-14177.84之间，说明该荧光定量方法可用于鸭组织中鸭疫里默氏菌的定量检测。

本发明建立的检测鸭疫里默氏菌的荧光定量pcr方法灵敏度高，特异性强，重复性好等特点，可用于鸭疫里默氏菌的定量检测，具有广阔的应用前景。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。