018]图3:欧洲鳗鲡肝脏细胞在体外长时程培养:a、EL细胞培养第5天；b、EL细胞培养第28天；c、EL细胞培养第111天。
[0019]图4:欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL细胞生长曲线。
[0020]图5:欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL冻存后复苏第8天光镜照片。
[0021]图6:欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL染色体型分析:a、EL细胞系染色体众数分布图；b、EL细胞系染色体型典型图(2n=38)。
[0022]图7:欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL感染鳗鲡疱疹病毒(HVA-1I)的光镜照片:a、感染后192小时接毒EL细胞；b、感染后192小时对照EL细胞。
[0023]【具体实施方式】:
为了更好地阐释本发明，下面将通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，但不限于此。
[0024]实例1:欧洲鳗鲡肝脏细胞的原代培养实验动物:
体长约20cm，体重20g左右的健康欧洲鳗鲡幼鱼。
[0025]试剂:
L-15 (购自Hyclone) ; 1000000U/10mg青-链霉素混合液、无水乙醇、碘酊(购自上海生工)；NaCl、Na2HP04、KC1、KH2P04、NaHCO3、胰蛋白酶(Trypsin)(购自 Sigma);胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)(购自 Gibco)。
[0026]仪器:
超净工作台(Air Tech);倒置荧光显微镜(Nikon);生化培养箱(博迅)；超纯水机(Millipore)0
[0027]耗材:
解剖用眼科剪、眼科镊、维纳斯剪(六六眼科)；25mL、50mL细胞培养瓶(BD Falcon)；15mL离心管(BD Falcon) ;5mL弯头玻璃滴管。
[0028]步骤:
I)试验用鱼的试前准备:欧洲鳗鲡幼体(黑仔鳗)在洁净海水中于室内暂养I?2周，期间不喂食饵料。
[0029]2)缓冲液和消化液配制:按标准配方配置20倍无钙镁D-Hanks储备液，以无菌超纯水稀释至工作浓度，以此为基础配置含终浓度为200U/mL的青霉素，以及终浓度为200 μ g/mL的链霉素的工作缓冲液和含0.25%胰蛋白酶的Trypsin消化液。
[0030]3)欧洲鳗鲡肝脏组织的获取:将上述仔鳗置于碎冰中行冰冻麻醉，至鱼体对物理刺激应激行为消失为止；以2%碘酊棉球充分擦拭鱼体表面去除黏液后，再以75%酒精棉球擦拭鱼体表面2?3次，由侧面剪开体壁，取出肝脏组织，置于(TC预冷并含青霉素及链霉素双抗的灭菌无钙镁D-Hanks溶液中，清洗5?6次。
[0031]4)原代及早期传代培养用完全培养液配制:制备以L-15培养基为基础，含终浓度为15%的胎牛血清，终浓度为200U/mL的青霉素，以及终浓度为200 μ g/mL的链霉素的原代及早期传代用完全培养液。
[0032]5)原代培养:将上述欧洲鳗鲡肝脏组织剪碎成0.5 mm3?Imm 3大小的组织块，以上述D-Hanks液漂洗，尽可能去除血细胞、脂肪组织及结缔组织；用少量不含血清的L-15培养基润湿培养瓶底面，将上述小组织块移入25mL培养瓶中，以0.3cm?0.5cm的间距均匀排列；倒置瓶身于20°C密闭培养6?8小时使组织块贴壁后，在培养瓶中加入ImL步骤4)所述培养液，缓慢翻正瓶身，使培养液浸润组织块，于20°C恒温启动原代培养；启动培养后每隔24小时缓慢添加完全培养液ImL至终体积为3mL左右，其后每72小时更换50%的完全培养液。
[0033]成果:
从接种后第48?72小时可见有细胞从组织块中迁出(图1:a&b)，二周左右可见细胞在组织块周围形成较清晰的放射状生长晕(图1:c&d)。
[0034]实例2:欧洲鳗鲡肝脏细胞的早期传代培养试剂:
L-15 (购自Hyclone) ； 1000000U/10mg青-链霉素混合液(购自上海生工)；NaCl、Na2HP04、KCl、KH2P04、NaHC03、胰蛋白酶(Trypsin)(购自 Sigma);胎牛血清(Fetal bovineserum, FBS)(购自 Gibco)
仪器:
超净工作台(Air Tech);倒置荧光显微镜(Nikon);生化培养箱(博迅)；超纯水机(Millipore);离心机(Beckman)
耗材:
25mL、50mL细胞培养瓶(BD Falcon) ;15mL离心管(BD Falcon) ;5mL弯头玻璃滴管步骤:
O原代及早期传代培养用完全培养液配制:制备以L-15培养基为基础，含终浓度为15%的胎牛血清，终浓度为200U/mL的青霉素，以及终浓度为200 μ g/mL的链霉素的原代及早期传代用完全培养液。
[0035]2)早期传代培养:收集生长良好，形成较大面积细胞层的原代培养物进行早期传代培养，传代前弃去培养液和脱落的组织块，用少量0.25%胰酶润洗细胞层，弃去，再加入足量胰酶消化细胞，待细胞呈收缩分离态势时弃去胰酶，加入如步骤I)所述完全培养液中止消化，以弯头滴管吹打培养物至细胞和组织块大部分分散脱落，收集细胞/组织悬浮液，100rpm离心3分钟，去除上清后，用完全培养液重悬沉淀，依照细胞和组织块数量以1:1?2:1的比例在27°C下进行富集化培养，重复以上程序直至确认培养物连续数代无污染迹象，传代后细胞能顺利形成铺满瓶底的单层，该过程一般需要传代5?6次。
[0036]成果:
传代5次后，残余组织块已在传代过程中自然分解消失，获得不含组织残块的纯粹培养细胞，细胞传代成活率显著上升，基本可长成汇合单层，并能按1:2比例扩大培养，同时细胞所需的血清比例分数有所下降(图2:a&b)。
[0037]实例3:欧洲鳗鲡肝脏细胞的常规传代培养和细胞系的建立:
试剂:
L-15 (购自Hyclone);甘油、甲醇、冰醋酸、Giemsa粉剂(购自上海生工);NaCl、Na2HP04、KC1、KH2P04、NaHC03、膜蛋白酶(Trypsin)(购自 Sigma);胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)(购自 Gibco)
仪器:
超净工作台(Air Tech);倒置荧光显微镜(Nikon);生化培养箱(博迅)；超纯水机(Millipore)
液氮罐(Locator),离心机(Beckman)
耗材:
50mL细胞培养瓶(BD Falcon), 250mL细胞培养瓶(Corning);15mL离心管(BD Falcon)；载玻片；5mL弯头玻璃滴管；标准玻璃脱色皿步骤:
I)常规传代培养完全培养液配制:制备以L-15培养基为基础，含终浓度为10%的胎牛血清，不含抗生素及其他营养添加物的常规传代培养用完全培养液。
[0038]2)常规传代培养:细胞能稳定形成单层后对其进行常规传代培养，以显微镜法对培养细胞进行连续观察，当细胞出现均匀的轻微堆叠现象时即行传代，用少量0.25%胰酶润洗细胞层，弃去，再加入足量胰酶(3mL/50mL细胞培养瓶)消化细胞30秒至I分钟，待上层细胞收缩变圆时弃去胰酶，加入如步骤I)所述的完全培养液，用弯头滴管轻柔吹打至上层细胞脱落制成悬液，将全部细胞悬液移入新瓶，27°C培养4?6小时，待细胞绝大部分贴壁后更换全部完全培养液，置于27°C恒温培养；含剩余底层细胞的原瓶加入等量完全培养液继续培养，每周完全更换培养液一次。
[0039]3)细胞的冻存及复苏:当细胞进入常规传代培养阶段后，对其分批进行液氮冷冻保存，冻存液组成为