70% L-15、20%胎牛血清以及10%DMS0 ;取处于对数生长期的细胞，依步骤2)所述消化方法获得细胞悬液后，1500rpm离心3分钟，弃去上清后以冻存液重悬细胞，按每管5X 15?IX 10 6细胞数分装于细胞冻存管内，置于内盛异丙醇的程序降温盒中，在4°C冷却30分钟到I小时后移入_70°C冰箱，待12小时后移入液氮长期保存；复苏细胞时，以37°C水浴迅速解冻样品，吸出细胞悬液后与步骤I)所述的完全培养液混匀接种于培养瓶内，12小时后更换培液，去除未成活细胞和DMSO成分后继续培养。
[0040]4)当细胞在体外连续培养超过18个月，且传代次数超过50代后，选择对数生长期的细胞，以秋水仙素法处理后进行染色体型分析。
[0041]成果:
随着传代次数的增加，欧洲鳗鲡肝脏细胞的生长趋于旺盛，传代间隔逐步缩短(图2:c?f)，但始终保有其在体外存活时间长的特性(图3);到第50?60代时传代周期稳定为4?6天，对数生长期细胞倍增时间为36.04小时(图4);在液氮中保存一个月的细胞复苏后其贴壁率可达80%以上，换液后成活率超过70%，外型为成纤维样细胞，形态均一稳定(图
5)，此时，细胞系建立成功，命名为EL，经染色体型分析实验，证明其为符合2n=38的二倍体细胞株(图6)。
[0042]实例4:对自建的欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL进行作为水产动物病毒宿主细胞的应用方法研究
试剂:
L-15 (购自Hyclone)、胎牛血清购自Gibco)，感染鳗鲡疱疹病毒(HVA-1I)的鳗鲡卵巢细胞(EO)冷冻样品(本实验室保藏)。
[0043]仪器:
超净工作台(Air Tech);倒置荧光显微镜(Nikon);生化培养箱(博迅)；液氮罐(Locator)
耗材:
250mL细胞培养瓶(Corning) ；5mL弯头玻璃滴管。
[0044]步骤:
O依照前文所述传代培养方法以5 X 15细胞数将EL细胞接种于250mL细胞培养瓶，36?48小时可长成新鲜单层。
[0045]2)将完全培养基更换为维持性培养基，27°C恒温孵育6小时。
[0046]3)取感染鳗鲡疱疹病毒(HVA-1I )的鳗鲡卵巢细胞(EO)冷冻样品，冻融3次后以弯头滴管充分吹打混匀备用。
[0047]4)取上述步骤3)中制备的病毒样品液，以300 μ L/瓶的用量接种于上述步骤2)中制备的实验用EL细胞，并以未接毒瓶作为对照。
[0048]5)以24小时为间隔对接毒后的EL细胞进行显微镜观察，并和对照细胞进行比较， 成果:
于接毒72小时后，观察到接毒样品中死亡细胞数量增多，168小时后细胞死亡达到高峰，光镜下可见细胞大面积皱缩脱壁，并有大量细胞碎片散布在培养瓶中，240小时后细胞死亡率达到95%(图7:a);而对照样品细胞生长良好，贴壁紧密，细胞密度有显著增加现象，培养基中仅有少量正常代谢产生的细胞碎片(图7:b)。
【主权项】
1.一株欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL，该细胞系于2014年12月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为CCTCC N0:C2014239o
2.一种如权利要求1所述的欧洲鳗鲡肝脏细胞系的构建方法，其特征在于:所述构建方法的步骤如下: 1)欧洲鳗鲡的试前准备:健康欧洲鳗鲡幼体黑仔鳗在洁净海水中于室内暂养I?2周，期间不喂食饵料； 2)欧洲鳗鲡肝脏组织的获取:将步骤I)准备好的仔鳗置于碎冰中行冰冻麻醉，至鱼体对物理刺激应激行为消失为止；以2%碘酊棉球充分擦拭鱼体表面去除黏液后，再以75%酒精棉球擦拭鱼体表面2?3次，由侧面剪开体壁，取出肝脏组织，置于(TC预冷并含青霉素及链霉素双抗的灭菌无钙镁D-Hanks平衡盐溶液中，清洗5?6次； 3)原代培养:将步骤2)得到的欧洲鳗鲡肝脏组织剪碎成0.5 mm3?Imm 3大小的组织块，以步骤2)所述灭菌无钙镁D-Hanks平衡盐溶液漂洗；用不含血清的L-15培养基润湿培养瓶底面，将漂洗后的组织块移入25mL培养瓶中，以0.3cm?0.5cm的间距均匀排列；倒置瓶身于20°C密闭培养6?8小时使组织块贴壁后，在培养瓶中加入原代及早期传代培养用完全培养液，缓慢翻正瓶身，使培养液浸润组织块，于20°C恒温下启动原代培养； 4)早期传代培养:收集生长良好的原代培养物进行早期传代培养，传代前弃去培养液和脱落的组织块，用0.25%胰酶润洗细胞层，弃去，再加入0.25%胰酶消化细胞，待细胞呈收缩分离态势时弃去胰酶，加原代及早期传代培养用完全培养液中止消化，以弯头滴管吹打培养物至细胞和组织块大部分分散脱落，收集细胞和组织悬浮液，100rpm离心3分钟，去除上清后用完全培养液重悬沉淀，依照细胞和组织块数量以1:1-2:1的比例在27°C下进行富集化培养，重复以上步骤直至确认培养物连续数代无污染迹象，传代后细胞能顺利形成铺满瓶底的单层； 5)常规传代培养:细胞能稳定形成单层后对其进行常规传代培养，以显微镜法对培养细胞进行连续观察，当细胞出现均匀的轻微堆叠现象时即行传代，用0.25%胰酶润洗细胞层，弃去，再加入0.25%胰酶消化细胞30秒至I分钟，待上层细胞收缩变圆时弃去胰酶，力口入常规传代培养用完全培养液，用弯头滴管轻柔吹打至上层细胞脱落制成细胞悬液，将全部细胞悬液移入新瓶，于27°C恒温下进行常规传代培养； 6)细胞的冻存及复苏:当细胞进入常规传代培养阶段后，对其分批进行液氮冷冻保存，冻存液组成为70%L-15、20%胎牛血清以及10%DMS0 ;复苏细胞时，以37°C水浴迅速解冻样品，吸出细胞悬液后与常规传代培养用完全培养液混匀接种于培养瓶内，12小时后更换培液，去除未成活细胞和DMSO成分后继续培养。
3.如权利要求2所述的欧洲鳗鲡肝脏细胞系的构建方法，其特征在于:步骤3)和4)所述原代及早期传代用完全培养液是以L-15培养基为基础，含终浓度为15%的胎牛血清，终浓度为200U/mL的青霉素，以及终浓度为200 μ g/mL的链霉素的完全培养液。
4.如权利要求2所述的欧洲鳗鲡肝脏细胞系的构建方法，其特征在于:步骤5)所述常规传代培养用完全培养液是以L-15培养基为基础，含终浓度为10%的胎牛血清，不含抗生素及其他营养添加物的完全培养液。
5.如权利要求1所述的欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL作为水产动物病毒宿主细胞的应用，其特征在于:取对数生长期的EL细胞，在维持性培养基环境下接种鳗鲡疱疹病毒HVA-1I。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于:所述维持性培养基以L-15培养基为基础，包含终浓度为2%的胎牛血清。
【专利摘要】本发明公开了一种欧洲鳗鲡肝脏细胞系及其构建方法和应用，属于海水鱼类细胞培养技术领域，该细胞系于2014年12月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为CCTCC NO:C2014239。本发明所述的欧洲鳗鲡肝脏细胞系为成纤维样细胞，能连续传代60代以上，且冻存复苏后贴壁良好，生长稳定，能直接用于水产病毒学、欧洲鳗鲡细胞生物学特性及免疫抗病基因功能的研究，并已被证实对鳗鲡疱疹病毒敏感。本发明的构建方法简便易行，重复性强，成本适中，也适用于其他欧洲鳗鲡细胞系的制备。CCTCC NO:C20142392014.12.16
【IPC分类】C12N7-00, C12R1-93, C12N5-071, C12R1-91
【公开号】CN104531608
【申请号】CN201510013504
【发明人】郑在予, 杨金先, 龚晖, 葛均青, 林天龙
【申请人】福建省农业科学院生物技术研究所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月12日