多特异单克隆抗体的制作方法

多特异单克隆抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多特异性抗体的产生，该抗体的特征在于，其以特异性和亲和性与多 个抗原结合的能力。尤其是，本发明涉及双特异性抗体。本发明还涉及结合一个以上靶标 的其他多特异蛋白质。
【背景技术】
[0002] 虽然众所周知，低亲和性（大约>luM)抗体通常结合多个抗原，但是通常将天然和 人工的亲和性成熟和优化方法（定向演化或者分子演化）设计成增加仅仅针对处于高亲和 性的分子的单个表位的亲和性和特异性。通常，对于大部分应用，特异性是重要的特性；例 如，在治疗学中特异性可以防止可能降低分子的安全性的脱靶效应。然而，结合有限数量 (例如2、3、4、5、6、7、8、9或者10,但是优选2或者3)的选定的靶抗原的能力具有实质的用 途，尤其是例如用于治疗其中存在多个活化路径的疾病，诸如与癌症相关的疾病。定期用单 克隆抗体对癌症进行免疫治疗，并不激活T-细胞，因为它们不表达Fc-受体。双特异性抗 体（一条臂结合肿瘤标志物，一条臂结合T-细胞特异表面抗原，例如CD3)可以克服该问题 并且连接肿瘤细胞和T-细胞。另外，三功能性抗体（具有2种不同的结合特异性和完整Fc 结构域的IgG)还可以结合至Fc受体表达细胞，如巨噬细胞和树突细胞。然后肿瘤细胞被 连接至免疫系统的一个或多个细胞，该免疫系统随后消灭肿瘤细胞。
[0003] 数个团队已经尝试设计双特异性抗体，例如通过双硫键还原拆分两个独立的抗体 的抗体重链，然后在氧化环境下再聚集抗体来制造异源抗体，从而Fab的二价IgG分子不同 并且结合至单独的抗原。该方法的缺点在于对相同的目标分子无亲合力，并且带来成本高 的产品生产及纯化过程。也开发了其他方案，其包括Fab内的序列扩增，有效地复制抗体上 的抗原结合口袋，从而每个结合口袋可以具有对单个抗体分子的不同抗原特异性。虽然这 简化了生产和纯化，但是该结构对于人体是外来的并且存在刺激患者内的负免疫反应的风 险。其他团队利用新颖的共价连接以实现多表位结合，从而产生"抗体类"分子。
[0004] 可能难以生产传统的双特异或者多特异性抗体。例如，通过表达同一细胞中的两 个单独的重链和两个单独的轻链可以构建这些抗体（Quadroma technology，Milstein et al，1983)，然而，该方法存在问题，因为除了期望的轻链1/重链1-重链2/轻链2异二聚 体，将总共形成10个可能的重链和轻链组合（Suresh et al.，1986)。多余的轻链/重链配 对的结合亲和性和特异性是未知的。为了降低得到的种群的可能的轻链/重链组装的复杂 性作出的努力包括诸如"件白"设计（"knob in hole"design, Ridgeway et al.，1996,通 过引用并入本文）的方法，其中可以修饰重链的Fc部分以消除一些同源二聚体的形成。然 而，即便是有这些改变，利用传统技术该种群仍然复杂。期望的双特异（或者多特异）产物 只是混合物的一小部分，使得双特异（多特异）抗体的纯化困难并且有时在许多情况下以 商业规模是不可取的。
[0005] 本发明的多特异性抗体的特征在于其以特异性和亲和性（例如，<10nM)结合至多 个抗原的能力。在一个方面，本发明的多特异性抗体包含两个不同的重链可变结构域（结 合两个或以上的不同抗原）、匹配两个重链可变结构域或者已经被优化以匹配两个重链的 单个轻链可变结构域、以及形成异源二聚体或者已经被优化以形成异源二聚体的Fc。可以 以若干途径实现本发明的多特异性抗体的构建。例如，在一种途径中，利用若干方法（包括 本文描述的方法）中的其中一种演化两个亲本单克隆抗体的可变结构域，从而同一单条轻 链可以在功能上补充来自亲本抗体的两条重链。还可以演化单个亲本抗体的重链，从而其 可以结合第二靶标，产生新的重链，随后用来自亲本抗体的轻链配对新的重链。在又一途径 中，可以演化单个亲本抗体的轻链，从而其可以结合第二靶标，产生新的轻链，然后用来自 亲本抗体的重链配对新的轻链。采用"杵白"型途径或者促使Fc形成或者导致Fc形成异 源二聚体的任何其他途径，可以产生形成本发明的多特异性抗体的异源二聚体的Fc部分。
[0006] 本文进一步描述了构建本发明的多特异性抗体的实例。
[0007] 在一个实施方案中，在分离本发明的多特异性抗体之后，通过演化方法可以 进一步改善多特异性抗体与一个或多个抗原或者靶标的亲和性，例如综合演化方法 (comprehensive evolution process)。在综合演化方法的一个方面中，在筛选期间鉴别高 表达突变体（up-mutant)，因为这些突变体改善与至少一个或两个抗原的结合而不会导致 降低与其中任一抗原的结合。然后可以进一步例如组合地混合和匹配这些高表达突变体 (改变可以位于重链和/或轻链内）。
[0008] 在某些其他例子中，期望与其中一个靶抗原的较低亲和性和与另一靶抗原的较高 亲和性。例如，Y. Joy Yu等在Science Translational Medicine, 25May 2011，Vol 3, Issue 8484ra44,"Boosting Brain Uptake of a Therapeutic Antibody by Reducing Its Affinity for a Transcytosis Target"上发表了一种双特异性抗体，其具有包含低亲和性 抗转铁蛋白受体抗体的一条臂和包括高亲和性BACE1抗体的另一条臂，该双特异性抗体能 够穿过血脑屏障并且在小鼠脑中达到治疗浓度。与亲本单特异抗体相比，该双特异性抗体 有效得多。
[0009] 因此，在综合演化方法的另一方面中，在筛选期间鉴别高表达突变体，因为那些突 变体改善与一个抗原的结合。虽然不优选导致与第二抗原的结合亲和性降低的突变体，但 是这些突变体在以组合方法在突变组合方法期间与其他突变组合时失去抑制效应的情况 下是有用的。基于候选物的整体亲和性以及其各自的与每一所选抗原的抗原：抗体结合的 打开和关闭率（on and off rate)，可以实施筛选以鉴别最重要的候选物。
[0010] 还可以优化本发明的多特异性抗体，以增加或者降低在其他条件中的活性或者稳 定性，诸如PH、氧化、温度、压力或者不同的离子浓度。
[0011] 附图简要说明
[0012] 图1示出本发明的H2L抗体的一个实施方案。H2L抗体具有优化的可变结构域，其 允许同一轻链与来自2个不同的亲本抗体（抗体1和抗体2)的2条重链中的每一条组装 而不改变对于特定抗原的结合特异性。轻链与来自抗体1的重链1组装而形成结合抗原1 的"Fab-臂1-H2L"。同一轻链还与来自抗体2的重链2组装而形成结合抗原2的"Fab-臂 2-H2L"。以只允许HC1-HC2二聚体在体内形成的方式修饰重链的Fc部分（例如，在本实例 中通过"杵白"设计促进，并且标记成Fc异源二聚体）。只形成异源二聚体的2条重链和单 条轻链的表达导致仅仅形成单一产物，即本发明的"H2L mAb"抗体。产生的每个分子具有 结合抗原1的一条Fab臂和结合抗原2的另一条Fab臂。可以类似于普通的IgG -样生产 和纯化H2L mAb。
[0013] 图2示出筛选排列的人类免疫球蛋白轻链文库的实例。用重链HC1和完全的人轻 链（不同的轻链位于每个孔中）组成的重组IgG孵育微量滴定板中固定的抗原靶标A。在 用抗人IgG-HRP缀合物清洗后检测结合的抗体。每个柱代表一独特的克隆。水平的黑线 表示背景活性；水平的虚线表示2x背景。将具有2x背景之上的信号的克隆作为主要标的 (primary hits)计数。X轴代表孔位置；y轴代表(?45(|值。
[0014] 图2示出双特异H2L mAb与两个靶抗原的结合的ELISA数据。用靶标A(灰柱）或 者靶标B (黑柱）涂覆微量滴定板的孔。与野生型轻链wtLCl或者新型轻链LC-1OT10组合 的重链1 (HC1)结合靶标A而不结合靶标B，而与野生型轻链wtLC2或者新型轻链LC-1OT10 组合的HC2结合靶标B。由HC1、HC2和新型轻链LC-MDIO组成的双特异H2L mAb结合靶 标A和靶标B两者。X轴代表克隆名称。Y轴代表0D45(I值。
[0015] 术语定义
[0016] 为了有助于理解本文提供的实例，将说明某些频繁出现的方法和/或术语。
[0017] 本文使用的术语"氨基酸"是指包含氨基基团（_NH2)和羧基基团（-C00H)的任 何有机化合物；优选作为自由基团，或者可选地，在缩合之后作为钛键的一部分。"20个天 然编码的形成多肽的a -氨基酸"按照本领域的理解并且是指：丙氨酸（ala或A)、精氨酸 (arg或R)、天门冬酰胺（asn或N)、天冬氨酸（asp或D)、半胱氨酸（cys或C)、谷氨酸（glu 或E)、谷氨酰胺（gin或Q)、甘氨酸（gly或G)、组氨酸（his或H)、异亮氨酸（ile或I)、亮 氨酸（leu或L)、赖氨酸（lys或K)、蛋氨酸（met或M)、苯丙氨酸（phe或F)、脯氨酸（pro 或P)、丝氨酸（ser或S)、苏氨酸（thr或T)、色氨酸（trp或W)、酪氨酸（tyr或Y)以及缬 氨酸（val或V)。
[0018] 术语"扩增"表示，多核苷酸的拷贝数量增加。
[0019] 本文使用的术语"抗体"是指完整的免疫球蛋白质分子（包括IgM、IgD、IgG、IgE 以及IgA同种型）以及免疫球蛋白质分子的能够结合抗原表位的片段，诸如Fab、Fab'、 (Fab'）2以及Fv片段。利用本领域公知的方法（参见例如Harlow and Lane,同上）可 以制作这些抗体片段，这些抗体片段保留一些能力以选择性地结合至其衍生自的抗体的抗 原，以下进一步说明这些抗体片段。
[0020] (l)Fab片段由抗体分子的单价抗原结合片段组成，并且该Fab片段可以通过木瓜 蛋白酶消化整个抗体分子以产生由完整的轻链和一部分重链组成的片段而产生。
[0021] (2)用胃蛋白酶处理整个抗体分子，然后还原，从而产生由完整的轻链和一部分重 链组成的分子，可以获得抗体分子的Fab'片段。每一以该方式处理的抗体分子，获得两个 Fab'片段。
[0022] (3)用胃蛋白酶处理整个抗体分子而不进行随后的还原可以获得抗体的（Fab)' 2 片段。（Fab)'2片段是两个Fab'片段通过两个二硫醚键连接在一起的二聚体。
[0023] (4)将Fv片段定义成包含表达为两条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程 片段。
[0024] 具有"嵌合"性质的分子是以下分子：1)与第一对照分子部分同源且部分异源；而 2)同时与第二对照分子部分同源且部分异源；而没有3)排除同时与一个或多个其他的对 照分子部分同源且部分异源的可能性。在非限制性实施方案中，通过组织部分分子序列的 重排可以制备嵌合分子。在非限制方面中，通过利用多个分子模板合成嵌合多核苷酸，可以 制备嵌合多核苷酸分子，从而使得得到的嵌合多核苷酸具有多个模板的性能。
[0025] 本文使用的"比较窗口"是指连续的核苷酸位置的概念段，例如20个或者更多的 连续的核苷酸位置，其中，多核苷酸序列可以与至少相同数量的连续核苷酸的对照序列相 比，以及其中，比较窗口中的多核苷酸序列的部分与对照序列（其不包含添加或者缺失）相 比，可以包括20%或更少的添增或者缺失（即缺口），用于两条序列的最佳比对。用于比 对比较窗口的最佳序列比对，可以通过以下方式来进行：Smith and Waterman(1981)Adv. Appl. Math. 2:482 的局部同源性算法、Needlemen and Wuncsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970) 的同源性比对算法、Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S. A. )85:2444(1988) 的相似法搜索、这些算法（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 中的GAP、 BESTFIT、FASTA、以及 TFASTA, Genetics Computer Group, 575Science Dr. , Madison, ffis.) 的计算机实施或者通过检查，并且选择由各种方法产生的最佳比对（即导致比较窗口上的 最高百分比的同源性）。
[0026] 本文所使用的术语"互补性决定区"和"⑶R"是指Kabat和Chothia例证的本领域 公认的术语。⑶R定义也通常公知为超变区或者高变环（Chothia and Leks，1987 ;Clothia et al.，1989 ;Kabat et al, 1987 ;以及 Tramontane) et al.，1990)。可变区结构域通常 包含天然存在的免疫球蛋白链的氨基端大约105-115个氨基酸（例如，氨基酸1-110)，但 是稍微短些或者长些的可变结构域也适合用于形成单链抗体。CDR是决定免疫球蛋白分 子的特异性并且与特异性配体接触的所述免疫球蛋白的一部分。CDR是所述分子最可变 的部分并且促成这些分子的多样性。在每个V结构域中存在三个⑶R区即⑶R1、⑶R2和 ⑶R3。⑶R-H描述可变重链的⑶R区，并且⑶R-L与可变轻链的⑶R区相关。H表示可变重 链而 L 表不可变轻链。可以如 Kabat (1991) .Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edit. , NIH Publication no. 91-3242U. S. Department of Health and Human Services,Chothia(1987).J.Mol.Biol.l96,901-917 以及 Chothia(1989) Nature, 342, 877-883中所述，确定Ig-衍生区的CDR区。
[0027] "保守氨基酸取代"是指具有相似侧链的残基的可交换性。例如，具有脂肪族侧链 的氨基酸组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸 组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧 链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和 组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代组是： 缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，以及天 冬酰胺_谷氨酰胺。
[0028] 本文使用的术语"去免疫"与产生模板结合分子的变体相关，通过使得所述变体相 对于原始野生型分子在人体中是非免疫原性的或者免疫原性较小，而修饰所述模板结合分 子。本发明的去免疫分子与非人类来源的抗体或其部分（如框架和/或CDR)相关。相应 的实例是如US 4361549中所描述的抗体或其片段。术语"去免疫"也与表现出产生T细胞 表位的倾向降低的分子相关。根据本发明，术语"产生T细胞表位的倾向降低"与导致特异 T-细胞激活的T-细胞表位的去除相关。
[0029] 另外，产生T细胞表位的倾向降低，表示促成T细胞表位形成的氨基酸的取代，即 对于形成T细胞表位是必要的氨基酸的取代。换句话说，产生T细胞表位的倾向降低与免 疫原性降低或者诱导抗原独立性T细胞增殖的能力降低相关。另外，产生T细胞表位的倾 向降低与去免疫相关，其意味着诱导抗原独立性T细胞增殖的氨基酸序列的潜在T细胞表 位的损失或者减少。
[0030] 本文使用的术语"T细胞表位"指可以在细胞内的肽、多肽或者蛋白质的降解期间 释放并且随后由主要组织相容性复合体（MHC)的分子呈递以便引发T细胞的激活的短肽序 列；尤其是参见WO 02/066514。对于由II类MHC呈递的肽，然后T细胞的这种激活可以通 过B细胞的直接刺激诱发抗体响应，从而产生所述抗体。
[0031] DNA的"消化"是指利用只在DNA中的特定序列处发挥作用的限制性内切酶催化 切割DNA。本文使用的各种限制性内切酶是可商购的，并且其反应条件、辅因子和其他需求 如本领域普通技术人员所公知地使用。对于分析目的，通常1 U g的质粒或者DNA片段与约 20 yl的缓冲溶液中的约2个单位的酶一起使用。出于分离DNA片段以便构建质粒的目的， 通常用更大体积的20-250单位的酶消化5-50 y g的DNA。特定的限制性内切酶的合适的缓 冲液和底物量由制造商指定。在37°C下通常使用约1小时的孵育时间，但是可以根据供应 商的指示改变。在消化之后，直接在凝胶上电泳该反应物以分离期望的片段。
[0032] 如本文所使用的，术语"表位"是指与抗体的抗体结合部位结合的抗原上的抗原决 定簇。抗原决定簇通常由化学活性表面分子组组成，诸如氨基酸或者糖侧链，并且可以具有 特异的三维结构特性，以及特异的电荷特性。本文使用的"表位"是指抗原或者能够形成结 合相互作用的其他大分子的、与抗体的可变区结合体相互作用的部分。通常，这种结合相互 作用显示为与CDR的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。
[0033] 如本文所使用的，术语"演化"是指定向演化或者分子演化的方法，其是为了期望 的性质通过实验修饰生物分子的方法，并且可以通过诱变一个或者多个亲本分子模板和在 后代分子中鉴别任何期望的分子来实现；许多演化方法（定向演化）是本领域公知和发表 的，包括定点诱变、易错PCR、位点饱和法、以及其他随机和非随机的方法。本发明的方法可 以使用这些方法中的任何方法。
[0034] 当提及对照多肽时，术语"片段"、"衍生物"和"类似物"包括保留至少一种与对照 多肽的生物功能或者活性至少基本上相同的生物功能或者活性的多肽。另外，术语"片段"、 "衍生物"或者"同源物"的实例是"原形式（pro-form) "分子，诸如可以通过切割修饰以产 生具有显著更高活性的成熟酶的低活性前蛋白（proprotein)。
[0035] 本文提供从模板多肽产生一组后代多肽的方法，在该组后代多肽中，每个氨基酸 位置处表示"全范围的单氨基酸取代"。本文所使用的"全范围的单氨基酸取代"是涉及天 然编码的20种天然编码的形成多肽