制备低内毒素壳聚糖的方法
【专利说明】制备低内毒素壳聚糖的方法
[0001] 本发明涉及制备低内毒素碱性壳聚糖的方法，还涉及制备低内毒素中性壳聚糖、 壳聚糖盐和壳聚糖衍生物的方法，并涉及这些方法的产物。
[0002] 壳聚糖特别用于制备控制出血使用的止血材料。
[0003] 壳聚糖是来自甲壳类动物处理的固体废物衍生物，并且可从真菌培养物提取。壳 聚糖是水不溶性阳离子聚合物质。在壳聚糖用于止血材料之前，通常首先转化成水溶性盐。 以这种方式，壳聚糖盐在血液中可溶形成阻止血流的凝胶。
[0004] 由于壳聚糖在身体中容易分解，壳聚糖盐理想适用于本文所述应用。壳聚糖通过 溶菌酶转化成葡糖胺，并因此自然从身体排泄。不必从身体去除壳聚糖。另外，壳聚糖盐显 示温和的抗菌性质，因此，它们的使用减小感染风险。
[0005] 为了在适用于控制出血的止血材料制备中利用壳聚糖，有必要保证壳聚糖具有足 够低的内毒素浓度。
[0006] 内毒素是格兰氏阴性菌的外膜表面上存在的脂多糖。内毒素对哺乳动物为高度毒 性，特别是对人，且众所周知难以从材料去除。在释放进入血流或通常未发现它们的其它组 织时，内毒素可变成热原性。因此，内毒素必须从药学上可接受的产物去除。
[0007] 处理去除或破坏热原，特别是内毒素，被称为"去热原"法。包含内毒素的材料去 热原的技术包括离子交换色谱、超滤、蒸馏和针对破坏内毒素的各种化学方法。
[0008] W02008063503涉及从壳聚糖去除内毒素的方法，所述方法包括以下步骤： a) 在无菌环境中使用无菌无热原设备和材料； b) 使包含内毒素的壳聚糖溶胀最多24小时； c) 使lkg/25L至1. 5kg/25L壳聚糖溶于0. 01M至4. 0M氢氧化物碱； d) 连续搅拌所得壳聚糖碱溶液； e) 在搅拌下，将溶液在60-100°C之间加热45分钟至4小时； f) 用最多l〇x体积超纯无内毒素水冲洗溶液； g) 将溶液中和到6. 8和7. 5之间的pH ; h) 形成超纯低内毒素壳聚糖浆料，并转移到无内毒素封闭系统； i) 从浆料去除过量水。
[0009] 这是一个复杂且费用大的过程，尤其需要无菌设备，且需要用10x体积无内毒素 的水冲洗溶液。
[0010] US2006293509涉及通过以下步骤制备具有低内毒素的水溶性壳聚糖的方法： (a) 使水不溶性壳聚糖与碱性溶液接触大于1小时的第一时间段； (b) 理想用无内毒素水冲洗水不溶性壳聚糖，以去除残余碱性溶液； (c) 使水不溶性壳聚糖在包含相转移剂的反应溶液中部分乙酰化； (d) 使部分乙酰化的水溶性壳聚糖溶于包含表面活性剂且具有约7. 0至约7. 4的pH的 水溶液； (e) 将水混溶性溶剂加入到水溶液，并进一步将水溶液的pH调节到至少8. 0的pH，以 使具有低内毒素含量的水溶性壳聚糖从水溶液/水混溶性溶剂混合物沉淀；和 (f)任选在非溶剂中洗涤，例如，异丙醇。
[0011] 然而，这一过程复杂且花费大，并且合乎需要包括使用大量无内毒素的水或其它 液体。此过程也需要使用相转移剂，并且经数小时进行。
[0012] TW593342涉及通过以下步骤减少壳聚糖中内毒素的方法： (a) 使包含内毒素的壳聚糖溶于水溶液； (b) 使水溶液与表面活性剂接触，以形成不溶性固体和内毒素含量减小的水溶液； (c) 使用固体/液体分离装置从水溶液分离固体。
[0013] 然而，这一过程需要表面活性剂与溶解的壳聚糖反应产生不溶性固体。得到的固 体为壳聚糖和表面活性剂的混合物或壳聚糖和表面活性剂之间的反应产物。
[0014] 本发明目的在于减轻前述困难。
[0015] 根据本发明的第一个方面，提供一种制备低内毒素碱性壳聚糖的方法，所述方法 包括以下步骤： (a) 使壳聚糖与碱性溶液接触，以形成混合物；和 (b) 让混合物保持至少约12小时。
[0016] 根据本发明的另一个方面，提供一种制备低内毒素碱性壳聚糖的方法，所述方法 包括以下步骤： (a) 使壳聚糖与碱性溶液接触，以形成混合物； (b) 让混合物保持至少约12小时；和 (c) 干燥混合物。
[0017] 本发明的方法提供得到具有低内毒素浓度的碱性壳聚糖的有效方式。所述方法有 利的是不需要洗涤步骤、冲洗步骤、使用表面活性剂或相转移剂、无菌设备和/或使用无内 毒素的水。另外，也不需要专用空气过滤或无菌条件。本发明的方法优选不包括使壳聚糖 乙酰化的步骤。
[0018] 本文所用术语"碱性溶液"是指具有大于pH 7. 5的pH值的溶液。
[0019] 由于内毒素的分子量可显著不同，因此，内毒素浓度以内毒素单位（EU)/克材料 测定。内毒素浓度的测定是内毒素水平相对于具体量参比内毒素的定量。
[0020] 例如，在本发明中，内毒素浓度以内毒素单位（EU)/克壳聚糖测定。本文所用术语 "低内毒素"是指具有小于1〇〇内毒素单位（EU)/克壳聚糖的内毒素浓度。
[0021] 因此，本发明的方法适用于制备具有小于l〇〇EU/g内毒素浓度的碱性壳聚糖。
[0022] 优选所得碱性壳聚糖具有小于50EU/g的内毒素浓度，更优选小于20EU/g，甚至更 优选小于15EU/g，最优选小于10EU/g。
[0023] 已发现，低浓度碱性溶液在本发明方法中优选。在所述方法中使用的碱性溶液的 浓度可以为约0.01M至约1M。优选碱性溶液的浓度小于1M。优选碱性溶液的浓度为约 0. 02M至0. 2M，甚至更优选碱性溶液的浓度为约0. 04M至0. 06M，一般0. 05M。碱性溶液的浓 度可以为约 〇? 01M、0. 05M、0. 10M、0. 15M、0. 20M、0. 25M、0. 30M、0. 35M、0. 40M、0. 45M、0. 50M、 0? 55M、0. 60M、0. 65M、0. 70M、0. 75M、0. 80M、0. 85M、0. 90M 或 0? 95M。已利用 0? 1M 碱性溶液的 浓度观察到良好结果。
[0024] 在一些实施方案中，碱性溶液与壳聚糖的量可以为约1份壳聚糖比约10份碱性溶 液至约10份壳聚糖比约1份碱性溶液。优选碱性溶液与壳聚糖的量为约1份碱性溶液比 约2份壳聚糖，更优选约1份碱性溶液比约1份壳聚糖。
[0025] 碱性溶液可包含碱或碱土金属（alkaline earth)组分，所述碱或碱土金属组分 选自单独或组合的以下组分：金属氢氧化物、金属碳酸盐、金属亚硫酸氢盐、金属过硅酸盐 (persilicate)、共轭碱和氢氧化铵。
[0026] 适合的金属包括钠、钾、钙或镁。
[0027] 优选碱组分为氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钠。一般使用氢氧化钠。
[0028] 可通过在本领域已知的任何适合方法使碱性溶液与壳聚糖接触。例如，可使碱性 溶液喷到壳聚糖上，或者可使壳聚糖与碱性溶液混合。优选碱接触的壳聚糖均匀分布。
[0029] 优选使壳聚糖与碱性溶液混合。在低分子量，壳聚糖可完全或部分溶于碱性溶液。 可使壳聚糖与碱性溶液混合最多约30分钟，更优选约10分钟。在一些实施方案中，可使壳 聚糖与碱性溶液混合大于30分钟。在一些实施方案中，可将壳聚糖和碱性溶液的混合物间 歇搅拌步骤（b)的持续时间。
[0030] 将壳聚糖和碱性溶液的混合物保持一段其中内毒素被碱破坏的时间。将壳聚糖和 碱性溶液的混合物保持至少约12小时。已发现，壳聚糖和碱性溶液的混合物保持的时间越 长，得到的碱性壳聚糖的内毒素浓度越低。在混合物已保持约12小时时，已观察到适合的 低内毒素浓度。本发明方法的另一个优势是，可保持混合物，而不需要不断混合壳聚糖与碱 性溶液。
[0031] 在一些实施方案中，混合物可保持至少约13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72 小时。
[0032] 优选保持混合物至少48小时。
[0033] 在一些实施方案中，混合物可保持至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、 65、66、67、68、69、70天或更长时间。
[0034] 在一些实施方案中，混合物保持约2至4星期（或14至30天）或更长时间。优 选混合物保持24小时和70天之间，更优选7天和35天之间，最优选14天和21天之间。
[0035] 通过使壳聚糖与0. 1M氢氧化钠溶液接触，并保持混合物约12至16天，优选约14 天，已观察到良好结果。
[0036] 可在室温和室内压力保持混合物。室温和室内压力是指约20_25°C温度和约1大 气压（atm)压力。有利的是，所述混合物不需要保持在无菌环境。