引入有氨基酸和甾基的透明质酸衍生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及被氨基酸修饰并引入有留基的透明质酸衍生物、该透明质酸衍生物和 药物的复合物、以及含有该透明质酸衍生物和药物的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于重组基因技术和化学合成技术的发展，以蛋白质和肽为活性成分的 制剂被实用化，其数量逐年持续递增。但是，蛋白质和肽难以通过消化管或粘膜等吸收，另 外在体内不稳定，血中半衰期短。因此，蛋白质制剂和肽制剂需要通过频繁注射来给药，给 患者和医务人员均带来很大的负担。期望开发出在不损害药理活性的情况下用于将蛋白质 或肽胶囊化的具有缓释性或靶向功能的DDS (药物递送系统）基材。另外，从给药效率的观 点考虑，期望向基材中尽可能地封装入大量的蛋白质、肽。
[0003] 已知，蛋白质和肽的药理活性因为它们的高维结构而比较大，由于与有机溶剂或 空气界面的接触、压力或温度、pH等外部环境引起的变性和凝集，蛋白质和肽的药理活性会 受到损伤。另外，当把变性或凝集的蛋白质给药于体内时，已知会增加抗原性等的风险。对 于以蛋白质或肽为活性成分的缓释制剂来说，从制剂化工序起，经过制剂的贮存期间，直至 给药后该活性成分在生物体内释放为止，寻求确保蛋白质和肽的稳定性。
[0004] 对于低分子药物来说，关于药物稳定性的课题与蛋白质?肽相比不那么大，但依然 对具有提高难溶性药物的溶解性的功能、或具有缓释性或靶向功能的 DDS基材存在很大需 求。
[0005] 另外，从安全性的角度考虑，用于制剂的基材必须兼具非抗原性、非诱变源性、无 毒性、生物降解性。
[0006] 近年来，报道有使用多糖作为药物载体的基材等。其中，透明质酸（HA)已知是于 1934年由K. Meyer从牛眼的玻璃体中分离出的生物材料（多糖），一直作为细胞外基质的 主要成分而熟知。HA是由D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺通过0 (1 - 3)糖苷键连接而成的 二糖单元构成的粘多糖的一种。HA在化学和物理结构方面没有种类的差异，人也具有对其 的代谢途径，HA是在免疫性和毒性方面最安全的医用生物材料（Biomaterial)之一。
[0007] 除了上述安全性等特性以外，近年来，透明质酸作为与细胞的粘附、增殖、移动的 诱导相关的生理活性物质的方面也备受瞩目。进而从制造的观点考虑，可以由微生物大量 生产高分子量的透明质酸，因此关于透明质酸的DDS研宄日益盛行。通过将药物与透明质 酸形成轭合物，据报道能够实现药物向癌组织的靶向（专利文献1)、向肝脏的靶向（专利 文献2)、降低抗原性等（专利文献3)。另外，报道了在生物体内存在CD44、RHAMM(调控透 明质酸介导的游走性的受体）、LYVE-1 (淋巴管内皮细胞透明质酸受体1)、HARE (胞吞透明 质酸受体）等HA受体（非专利文献7和非专利文献8)。特别是CD44和RHAMM在大量的 癌细胞中过表达，因此正在尝试使用HA作为癌靶向载体的基材。作为其粒子，可举出紫杉 醇-HA轭合物（非专利文献9?11和专利文献12)、喜树碱-HA轭合物（专利文献13)、多 柔比星-HPMA[N-(2-羟丙基）甲基丙烯酰胺]-HA轭合物（非专利文献12)、酪酸-HA轭合 物（非专利文献13)、多柔比星封入HA-PEG-PLGA纳米粒子（非专利文献14)、siRNA封入 HA凝胶（非专利文献15)、多柔比星封入HA被覆脂质体（非专利文献16)等。进而，非专 利文献17报道了通过酰胺键引入的经由乙二胺连接基与胆酸轭合的HA衍生物。以这些HA 为基材的载体可在体外被有效地吸收到CD44高度表达的细胞中（例如非专利文献9)。但 是，在将HA系统给药时，已知HA可被肝脏等的肝窦内皮细胞中存在的HARE受体瞬间吸收 而代谢，迅速从血中消失（非专利文献18?20)。这样，在使用透明质酸来延长滞留性或作 为靶向用DDS基材时，其在血中滞留时间短成为缺点。认为透明质酸的连续6个糖单元是 受体的识别部位，通过修饰羧基，试图进行血中滞留时间的延长（专利文献4、5和6)。
[0008] 通过高度修饰透明质酸的葡糖醛酸部分的羧基，开发出了实现血中滞留性长期化 的透明质酸衍生物，公开了其有用性（专利文献7)。一般来说，通过提高葡糖醛酸部分的 羧基的修饰率，也可以使透明质酸衍生物的血中滞留性长期化。但是，已知两者并非线性相 关，在某一阀值处，滞留性就会发生急剧变化。
[0009] 作为透明质酸中的羧基被氨基酸修饰的粒子，例如可举出在N-甲基吗啉的 存在下，使用通过采用2-氯-4, 6-二甲氧基-1，3, 5-三嗪而生成的4-(4, 6-二甲氧 基-1，3, 5-三嗪）-4-甲基吗啉鐵(以下也称为DMT-MM)作为缩合剂，通过甘氨酸的乙酯的 修饰，但修饰率最大为20% (非专利文献1)。另外，作为使用三嗪系化合物作为缩合剂的 例子，报道了引入有丙氨酸的透明质酸对酶解的抗性增强，可期待用作粘性的添加物（非 专利文献2)、还报道了通过类似的方法，用其他的氨基酸进行的修饰（非专利文献3,专利 文献9)。另外，还存在使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（以下也称为 EDC)作为缩合剂，通过用亮氨酸的甲酯盐酸盐、缬氨酸的甲酯盐酸盐、异亮氨酸的甲酯盐酸 盐、脯氨酸的甲酯盐酸盐、苯丙氨酸的甲酯盐酸盐、精氨酸的甲酯盐酸盐和组氨酸的甲酯盐 酸盐修饰，在不脱保护的情况下凝胶化，制备非水溶性的生物相容性的膜的例子，但不知晓 修饰率（专利文献8)。另外，在本申请优先权日以后公开的专利文献15中报道了，通过将 透明质酸的羧基用特定的氨基-羧酸或其酰胺修饰而得到的透明质酸衍生物，兼具生物降 解性和血中滞留性两者，而且对药物从胞内体向细胞质内的释放有效。
[0010] 另外，报道了 ：作为来自多糖的药物载体，引入有胆留醇基等的普鲁兰多糖衍生物 在水溶液中形成纳米尺寸的微粒，具有作为与疏水性低分子、肽、蛋白质等形成复合物的主 分子的功能（非专利文献4)。通过对摄取蛋白质后的该普鲁兰多糖衍生物进行热力学评价 可知，被摄取的蛋白质由于与普鲁兰多糖的羟基之间形成氢键而稳定化（非专利文献5)。
[0011] 另外，还报道了羧基甲基纤维素（CMC)(专利文献10)和引入有亚油酸的壳聚糖 (非专利文献6)用作与蛋白质的复合物形成材料。进而，专利文献11中，报道了一种包含 具有交联基的透明质酸衍生物和具有疏水基的亲水性多糖类衍生物的组合物，其中，具有 交联基的透明质酸衍生物是通过在亲水性多糖类衍生物的存在下，透明质酸或具有可交联 基团的其衍生物的交联形成反应而制备的。专利文献14报道了，具有胆留醇基作为疏水基 的基团引入到透明质酸中的透明质酸衍生物通过在水中缔合而形成微粒，从而形成与药物 的复合物。
[0012] 现有技术文献
[0013] 专利文献
[0014] 专利文献1 :国际公开W092/06714号小册子
[0015] 专利文献2 :特开2001-81103号公报
[0016] 专利文献3 :特开平2-273176号公报
[0017] 专利文献4 :特开平5-85942号公报
[0018] 专利文献5 :国际公开W001/05434号小册子
[0019] 专利文献6 :国际公开W001/60412号小册子
[0020] 专利文献7 :国际公开W02006/028110号小册子
[0021] 专利文献8 :国际公开W092/20349号小册子
[0022] 专利文献9 :国际公开W02011/148116号小册子
[0023] 专利文献10 :国际公开第W02002/022154号
[0024] 专利文献11 :国际公开第W02008/136536号
[0025] 专利文献12 :国际公开第W02004/035629号
[0026] 专利文献13 :国际公开第W02009/074678号
[0027] 专利文献14 :国际公开第2010/053140号
[0028] 专利文献15 :国际公开第2012/118189号
[0029] 非专利文献
[0030] 非专利文献 1 :Biomacromolecules，第 8 卷，第 2190-2195 页，2007 年
[0031] 非专利文献 2 :CARBOHYDRATE Polymers，第 86 卷，第 747-752 页，2011 年
[0032] 非专利文献 3 :CARBOHYDRATE Polymers，第 87 卷，第 2211-2216 页，2012 年
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