R-598-3p的含量的试剂。优选地，所述试剂是检 测miR-598-3p的引物，检测miR-598-3p的引物由正向引物序列和通用反向引物组成；所述 正向引物序列如SEQ ID NO. 1所示。作为一种可替代的技术方案，上述人类乳腺癌诊断试 剂盒包括检测人类血清中miR-598-3p的含量的试剂和检测CA153蛋白含量的试剂。优选 地，检测人类血清中miR-598-3p的含量的试剂是检测miR-598-3p的引物，检测miR-598-3p 的引物由正向引物序列和通用反向引物组成；所述正向引物序列如SEQ ID NO. 1所示；检 测CA153蛋白含量的试剂是CA153抗体，所述检测CA153的抗体可从商业途径获取，只要能 检测血清中CA153的含量即可。
[0019] 进一步，上述人类乳腺癌诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆 转录酶、逆转录缓冲液、逆转录核酸混合物、DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品。
[0020] 进一步，上述人类乳腺癌诊断试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的 辅助试剂是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均 是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如（但不限于）：显色剂、洗涤液、终止液、稀释 液。还可以包括Constar 8联孔酶标条、不干胶封膜。
[0021] 可使用本领域技术人员所熟知的多种技术（例如定量或半定量RT-PCR，RNA印迹 分析，溶液杂交检测等）测定血清miR-598-3p在乳腺癌患者和健康人群中的水平。在本发 明的具体实施方案中，使用了定量PCR的方法。
[0022] 本发明还提供了一种非诊断目的的血清标志物miR-598_3p的检测方法，所述方 法包括以下步骤：
[0023] (1)提取总RNA，在RNA提取过程中加入外源性参照物；
[0024] (2)将步骤（1)获得的RNA逆转录成cDNA ;
[0025] (3)在荧光实时定量PCR仪上将步骤（2)获得的cDNA进行扩增；扩增所需的引 物由正向引物序列和通用反向引物组成；对于miR-598-3p来说，正向引物序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0026] 本发明还提供了一种诊断人类乳腺癌的方法，所述方法包括以下步骤：
[0027] (1)提取总RNA，在RNA提取过程中加入外源性参照物；
[0028] (2)将步骤（1)获得的RNA逆转录成cDNA ;
[0029] (3)在荧光实时定量PCR仪上将步骤（2)获得的cDNA进行扩增；扩增所需的引 物由正向引物序列和通用反向引物组成；对于miR-598-3p来说，正向引物序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0030] (4)通过融解曲线和扩增曲线分析，2_AACT法进行相对定量。
[0031] (5)对miR-598-3p进行logistic回归分析，建立单因素回归模型Logit(P)= 4. 315-5. 719XmiR-598-3p，将样本miR-598-3p的相对表达量代入方程中，若计算值高于 1. 175,则诊断为乳腺癌；若计算值低于1. 175,则判断为非乳腺癌。
[0032] 外源性参照物，用于标准化提取、反转录及控制后续的定量检测全过程操作的样 本间差。
[0033] 本发明使用的计算相对表达水平的外源性参照物包括但不限于： miRNA-67(Accession :MI0000038,秀 _ 隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)miR_67 莖-环（stem-loop) )、miRNA-356 (Accession :MI0000755,秀 _ 隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)miR_356 莖-环（stem-loop))、线虫 39-miRNA(Cel_miR-39)。在本发明的具体实 施方案中，本发明使用的人工合成线虫39miRNA(Cel-miR-39)及其扩增引物购自QIAGEN公 司，货号为：219610 ;Cel-miR-39使用终浓度为5iimol/L。
[0034] 本发明使用的通用反向引物购自QIAGEN公司，货号为：218073。
[0035] 可以采用加尾法或茎环法将总RNA中的miRNA反转录成cDNA。
[0036] 加尾法的实验原理是：在小RNA 3'末端由poly A聚合酶加上一段poly A尾巴， 然后用一个3'末端含有一段poly T的长引物将miRNA逆转录成cDNA，所得到的cDNA的长 度比较适合进行荧光定量PCR。
[0037] 茎环法的实验原理是：该方法应用了一个单一的茎环状的引物，避免对目的 miRNA进行加尾。反应过程分两步：首先，茎环状引物与目的miRNA分子的3'端结合，引物 3'端与miRNA3'端有6个互补配对的核苷酸，然后用逆转录酶将之逆转录成cDNA第一链。 其次是PCR反应。cDNA第一链的茎环状结构打开后链的长度增加了，以其为模板即可进行 传统的荧光定量PCR。茎环状引物的茎部为双链结构，防止引物与pre-miRNA或其他长链 RNA的杂交；莖部的碱基堆积增强了 miRNA和DNA异质双链的亲合力，提高了逆转录的效 率；且茎环状结构展开后增加了 miRNA的长度，为随后进行的PCR反应提供了合适的模板。
[0038] 在本发明的具体实施方案中，采用反转录试剂盒（购自QIAGEN公司，货号为： 218161)将miRNA反转录成cDNA，反转录体系配制如下：
[0039]
【主权项】
1. 一种与人类乳腺癌相关的血清标志物，其特征在于，所述标志物为miR-598-3p。
2. -种与人类乳腺癌相关的血清标志物，其特征在于，所述标志物为miR-598-3p与 CA153的组合。
3. -种权利要求1或2所述的标志物的检测试剂，其特征在于，对于miR-598-3p来说， 所述试剂能够检测人类血清中miR-598-3p的含量；对于miR-598-3p与CA153的组合来说， 所述试剂能够同时检测人类血清中miR-598-3p和CA153的含量。
4. 根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，对于miR-598-3p来说，所述试剂包括检测 miR-598-3p的引物；对于miR-598-3p与CA153的组合来说，所述试剂包括检测miR-598-3p 的引物和检测CA153的抗体；检测miR-598-3p的引物由正向引物序列和通用反向引物组 成；所述正向引物序列如SEQ ID NO. 1所示；通用反向引物由商业途径获取。
5. -种人类乳腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3或4所述的试 剂。
6. 权利要求1或2所述的标志物在制备人类乳腺癌诊断试剂中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂为权利要求3或4所述的试剂。
8. 权利要求3或4所述的试剂在制备人类乳腺癌诊断试剂盒中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为权利要求5所述的试剂盒。
10. -种非诊断目的的权利要求1所述的标志物的检测方法，其特征在于，所述方法包 括以下步骤： (1) 提取总RNA，在RNA提取过程中加入外源性参照物； (2) 将步骤（1)获得的RNA逆转录成cDNA ; (3) 在荧光实时定量PCR仪上将步骤⑵获得的cDNA进行扩增；扩增所需的引物由正 向引物序列和通用反向引物组成；对于miR-598-3p来说，正向引物序列如SEQ ID NO. 1所 示；通用反向引物由商业途径获取； (4) 通过融解曲线和扩增曲线分析，f ACT法进行相对定量。
【专利摘要】本发明公开了一种与乳腺癌相关的血清miRNA标志物及其应用。该标志物为miR-598-3p或miR-598-3p与CA153的组合。该标志物及其引物可用于制备诊断试剂盒，用于人类乳腺癌的早期诊断。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-113
【公开号】CN104673921
【申请号】CN201510116249
【发明人】李招云, 付伦, 王攀, 朱杰
【申请人】李招云
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月17日