下游引物：5-CTGTCCGCAGTCCTTAGC-3
[0033] 构建的pEZ-M61-EphrinB2载体的质粒图谱如图1所示。
[0034] b.pEZ-M61-EphrinB2 表达载体转染HEK293 细胞
[0035] 采用脂质体2000将质粒转入HEK293细胞（脂质体2000购自美国 GIBCO,Invitrogen公司，按照脂质体2000试剂盒说明书操作），DMEM培养基（Dulbecco's ModifiedEagleMedium)加G418浓度500yg/mL筛选14天后，得到的阳性克隆在倒置 荧光显微镜下均带有绿色荧光，挑取G418抗性单克隆传代培养，4周后调整G418浓度为 300yg/mL的DMEM培养基培养，得到含pEZ-M61-EphrinB2阳性转染的克隆细胞株。
[0036] DMEM培养基加G418筛选阳性细胞14天后，作为对照的HEK293细胞培养图如图2a 所示；重组J1EK293细胞，即HEK293-EphrinB2阳性细胞的细胞培养图如图2b、2c所示；未转 染质粒pEZ-M61-EphrinB2 的HEK293 细胞全部死亡，转染有pEZ-M61-EphrinB2 的HEK293 细胞部分死亡，同时存活细胞在倒置荧光显微镜下均带有绿色荧光，这与转染质粒含有抗 G418抗性基因和绿色荧光蛋白GFP基因有关，表明质粒pEZ-M61-EphrinB2成功转入宿主细 胞HEK293。
[0037] c.对转染细胞株的RT-PCR检测：
[0038] 采用TRIZ0L试剂盒分别提取未转染和转染的细胞总RNA，并以总RNA为模板采用 TAKARA公司的cDNA合成试剂盒进行反转录，得到cDNA;
[0039] 分别以所得cDNA为模板，PCR扩增EphrinB2基因全长。
[0040]PCR反应体系为：SYBR?PremixExTaq?II12. 5yL;上游引物 (sense, 20ymol/L) 0? 5yL;下游引物（antisense, 20ymol/L) 0? 5yL;模板（cDNA) 2yL;ddH209. 5yL；Total：25yL〇
[0041] ?〇?反应条件：95°0预变性308,951：变性58,601：延伸308，循环40次；1?1'-?〇? 检测结果如图3所示，1为重组HEK293细胞，2为转染空质粒的HEK293细胞，3为未转染的 HEK293细胞作阴性对照；与2、3相比，1中EphrinB2基因水平明显升高，最高表达EphrinB2 受体量较转染前提高29. 3倍。GAPDH组为EphrinB2组的阳性参照。
[0042] 将PCR产物做凝胶电泳检测，结果如图4所示，其中，泳道1为Marker，泳道2为转 染pEZ-M61-EphrinB2的重组HEK293细胞，泳道3为未转染的HEK293细胞，泳道4为转染 空载体的J1EK293细胞；
[0043] 与泳道3、4相比，泳道2得到的187bp左右的条带明显高于泳道3、4,琼脂糖凝胶 电泳检测结果表明重组HEK293细胞的EphrinB2表达明显上调。
[0044] d.倒置焚光显微镜下重组HEK293细胞中EphrinB2的表达及其与EphB4受体的结 合
[0045] 在倒置荧光显微镜下下观察重组HEK293细胞的EphrinB2的表达，结果如图5所 示，其中a为对照组HEK293细胞，b为重组HEK293细胞，从图5中可以看出对照组HEK293 细胞无绿色荧光，而重组J1EK293细胞绿色荧光较亮，说明其EphrinB2表达量显著增加。
[0046] 取生长状态良好接近汇合的重组HEK293细胞，0.25 %胰蛋白酶消化，计数，按 1X104个/孔浓度接种于96孔培养板内，每孔体积200uL，将EphB4-Fc原液（lmg/mL)稀 释后加入96孔培养板内，使其终浓度为2. 5ug/mL孵育细胞，37°C培养箱中培养24h，由于重 组HEK293细胞本身带有绿色荧光，因此同一视野下拍照合成图片如图6所示，可见绿色与 红色重合，说明重组HEK293细胞高表达EphrinB2且能够与其配体（受体）EphB4-Fc较好 的结合。
[0047] e.WesternBlot检测EphrinB2 的表达量
[0048] 用裂解液RIPA裂解细胞后提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白含量。经电泳、转 膜、免疫染色（一抗：兔抗人EphrinB2多克隆抗体，购于Abeam公司；二抗：山羊抗兔，购于 博奥森公司）和显影，实验结果如图7所示，其中，1为重组HEK293细胞，2为转染空质粒的 HEK293细胞，3为未转染的HEK293细胞。与2、3相比，1中目标蛋白EphrinB2的表达量明 显升高，2、3中EphrinB2的表达量较少；GAPDH组为EphrinB2组的阳性参照。
[0049]f.重组HEK293细胞的活性分析
[0050] 用MTT法分析达沙替尼对重组HEK293细胞增殖的影响。
[0051] 取对数生长期的重组册1(293细胞，0.25%膜蛋白酶消化，计数，按1\104个/孔 浓度接种于96孔培养板内，每孔体积200uL，37°C、5%C02、饱和湿度条件下培养24h后， 加入达沙替尼溶液20uL，使达沙替尼终浓度分别为6. 1、12. 2、24. 4、48. 8、97. 7、195. 3、 390. 6mmol/L，对照组加入等量药物溶剂，每个浓度5个复孔。继续培养48h后，小心吸弃孔 内培养液，每孔加入无血清培养基200uL，然后加入5mg/mLMTT溶液20uL，37°C孵育4h。小 心吸弃孔内培养液上请，每孔加入150uLDMS0,振荡lOmin，使结晶物充分溶解，用酶标仪测 定490nm波长下各孔吸光度值，取各复孔吸光度平均值，根据下式计算达沙替尼对细胞的 抑制率：
[0052] 抑制率（％ ) =(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值）X100%
[0053] 以药物浓度为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标作图，得到抑制作用曲线，如图8 所示：随着达沙替尼浓度的增大，达沙替尼对重组J1EK293细胞的抑制作用明显增强，经计 算，达沙替尼的半数抑制浓度IC50为107. 9nmol/L;这说明重组细胞的EphrinB2与达沙替 尼结合后，抑制了EphrinB2高表达的重组细胞的生长。
[0054] 综上所述，本发明提供的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞可以用于筛选以 EphrinB2为祀点的药物，从而进一步得到能够消除EphrinB2对肿瘤发展的影响的药物。
【主权项】
1. 一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞，其特征在于：该重组细胞是以HEK293细 胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EphrinB2全长基因的表达载体。
2.根据权利要求1所述的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞，其特征在于：所述的 EphrinB2全长基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
3.根据权利要求1所述的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞，其特征在于：所述的 包含EphrinB2全长基因的表达载体是pEZ-M61-EphrinB2,其中pEZ-M61-EphrinB2是将 EphrinB2全长基因克隆到载体pEZ-M61中。
4.根据权利要求3所述的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞，其特征在于：所述的 pEZ-M61-EphrinB2的引物序列为： 上游引物：5-TCATCTTCATCGTCATCATCATC-3 下游引物：5-CTGTCCGCAGTCCTTAGC-3。
5.权利要求1所述的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞在以EphrinB2为靶点的药 物筛选中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的以EphrinB2为祀点的药物为能够与 受体EphB4-Fc结合的药物。
【专利摘要】本发明公开了一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EphrinB2全长基因的表达载体。与现有只含EphrinB2胞外区或部分基因序列构建的重组细胞相比，本发明构建的包含EphrinB2基因全长的重组HEK293细胞膜能够稳定的表达EphrinB2分子，而且具有完整的分子活性。MTT法检测在一定浓度下达沙替尼对重组HEK293细胞有良好的作用，因此可以在以EphrinB2为靶点的药物筛选中应用。
【IPC分类】C12N5-10, C12Q1-02
【公开号】CN104694477
【申请号】CN201510094921
【发明人】贺浪冲, 张彦民, 刘艳萍, 代秉玲, 马维娜, 刘瑞, 王文捷
【申请人】西安交通大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月3日