化R0)E3)大肠杆菌；从美国Novagen公司引进，本实验室保存。
[0039] 4.P化uttle-CMV载体；从美国Stratagene公司引进，本实验室保存。文献； BenihoudK,YehP,Perricaudet,M.Adenovirusvectorsforgenedelivery.Current OpinioninBiotechnology, 1999, 10巧）：440-447.
[0040] 5.pEGFP-Nl载体；从美国抓BiosciencesClontech公司引进。文献；Prasher DC,EckenrodeVK,WardWW,etal.Primarystructureoftheaequoreavictoriagreen fluorescentprotein.Gene, 1992, 111(2):229-233.
[0041] 6.祀T/EI-GFP载体；从美国普林斯顿大学引进，本实验室保存。文献；Fong BA,WoodDW.ExpressionandpurificationofELP-intein-taggedtargetproteinsin highcelldensityE.colifermentation.MicrobialCellFactories, 2010, 9:77.
[0042] 7.pUC57载体；从美国GeneScript公司引进，本实验室保存。
[0043]8.PK-15细胞；从美国ATCC引进（ATCCC化-33)，本实验室保存。
[0044] 9.NIH3T3细胞；从美国ATCC(CRL1658)引进，本实验室保存。
[0045] 10. CH0-K1细胞；从美国ATCC(C化-61)引进，本实验室保存。
[0046] 11.AAV-293细胞；从美国Stratagene公司引进，本实验室保存。
[0047] 具体操作步骤如下：
[0048] 1.ELP-CAR融合表达载体构建
[0049] (1)利用在线软件JAVACodonAdaptionTool(文献；GroteA,HillerK，Scheer M,MilnchR,N6rtcmannB,HempelDC,JahnD.JCat:anoveltooltoadaptcodonusage ofatargetgenetoitspotentialexpressionhost.NucleicAcidsRes. 2005,1 ;33)， 将CARD1结构域编码序列（GenBankAccessionN〇:NM_001207066)优化成大肠杆菌化12 株）偏爱密码子序列，由南京金斯瑞生物有限公司合成，克隆在pUC57质粒载体中。
[0050] 似设计下列1对引物，正向引物引入EcoRI酶切位点和CARD1与D2结构域间隔 序列（GenBankAccessionN〇:NM_001207066)，反向引物引入甜al酶切位点；
[0化1] 正向引物；
[0052] 5-GGTGAATTCCTGGTTAAACCGTCTGGTGCTCGTTGCTACGTTGACGGTTCTGAAGAAATCGGTTCT GACTTCTCTATCACCACCCCG-3(SEQIDNO. 1)；
[0化引 反向引物；5-ggti￡1mattaaccagacggtttaaccagaa-3(seqidno. 2)。
[0054] W含CA畑1结构域序列的pUC57质粒为模板，按照Ex"TagiMpoiymerase(Ka^TaRa公 司）说明书，用PCR扩增带有间隔序列的CARDl结构域序列，用限制酶EcoRI和甜al消化 后备用。
[0化5] (3)用限制酶EcoRI和甜al消化祀T/EI-GFP载体，电泳分离后胶回收切除GFP 序列的载体片段，与上述CARD1结构域序列连接，获得重组载体祀T-ELP-CAR (图1)。
[0056] (4)用限制酶EcoRI和甜al对重组载体祀T-ELP-CAR进行酶切鉴定，结果能释放 出预期大小的插入片段；将重组质粒送南京金斯瑞生物有限公司进行序列测定，结果显示 插入序列无突变。
[0057] 2. ELP-CAR融合蛋白的诱导表达与纯化
[0化引 （1)将重组质粒祀T-ELP-CAR转化化R0)E3)大肠杆菌，在氨节青霉素（100yg/ mL)LB平板培养过夜；挑取单菌落接种5mL氨节青霉素LB，37°C摇床培养过夜，4°C、8000g离屯、lOmin;沉淀菌体W等体积LB重悬，W1:100比例接种500血氨节青霉素2XYT培 养液（Tiyptone16g，YeastExtractlOg，化(31 5g)，37°C、230巧m培养至孤日00= 0.8; 加入0. 5mmol/LIPTG，20 °C、150巧111诱导表达2化；4 °C、4000g离屯、lOmin，沉淀菌体用 PBS(抑7. 4)离屯、洗漆3次；将少量重组菌体用PBS悬浮，用超声波仪裂解后离屯、，分别收集 上清和沉淀进行电泳分析，结果显示重组菌能表达预期的62kDaELP-CAR融合蛋白，表达产 物存在于裂解菌体的离屯、上清中（图2)。
[0化9] (2)用50mLPBS(pH7. 4)重悬其余菌体，按照细胞破碎仪（广州聚能生物科技有限 公司）在4°C裂解2次（ISOObar) ;4°C、16000g离屯、20min，收集上清液；用Super-Bra壯ord蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）测定菌体裂解液蛋白浓度，用PBS调 整蛋白浓度为5mg/mL。
[0060] 做ELP-CAR融合蛋白的相变温度测定参考文献化ang町，Kim化化ang WJ.Heterologousexpressionandoptimizedone-stepseparationoflevansucrase viaelastin-likepolypeptidestaggingsystem.MicrobiologyandBiotechnolo gy，2007, 17(11) : 1751-1757)进行，所用氯化钢浓度为1. 5mol/l，测得的ELP-CAR融合蛋 白的相变温度为26 °C。
[0061] (4)纯化ELP-CAR融合蛋白的温度敏感相变循环参考文献（ShenY，Ai HX,SongR,etal.ExpressionandpurificationofmoricinCM4andhuman beta-defensins4inEscherichiacoliusinganewtechnology.Microbiological Research，2010, 101:229-240)进行，所用氯化钢终浓度为1. 5mol/l，解育条件为26°C、 lOmin，离屯、条件为室温、14000g、5min，收集的沉淀即为初步纯化的ELP-CAR融合蛋白；在 相同条件下重复相变循环1次，取部分纯化产物进行12%SDS-PAGE分析，结果显示纯化的 ELP-CAR融合蛋白为单一条带（图2)。
[0062] (5)按照与纯化ELP-CAR融合蛋白同样的方法，从祀T-ELP重组大肠杆菌纯化 HiS-ELP融合蛋白；取HiS-ELP和ELP-CAR融合蛋白各 10yL(0. 5mg/mL)进行SDS-PAGE 分离，按照蛋白转印系统炬io-Rad公司）说明书转印巧0V，2h)硝酸纤维素膜，用常规 Western-blotting对ELP-CAR融合蛋白进行鉴定，一抗为1 ;500CAR特异抗体（上海圣克鲁 斯生物技术有限公司产品），二抗为1 ;1〇〇〇〇稀释Dyli曲t?800 1油eledGoatanti-Mouse IgG(K化公司），杂交信号用Odyssey红外巧光扫描成像系统（美国LI-COR公司）扫描成 像。结果显示；CAR特异抗体与ELP-CAR融合反应阳性，与His-ELP融合蛋白反应阴性（图 3) 〇
[0063] 3.重组腺病毒的构建
[0064] (1)根据祀GFP-N1载体中GFP基因序列设计下列引物；
[00化]正向引物：5-ATCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAG-3 (引入化〇1 位点）（SEQIDNO. 3);
[0066] 反向引物：5-CGAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCC-3 (引入 Hindlll 位点）（SEQID NO. 4) 〇
[0067] W祀GFP-Nl载体为模板，按照ExhgTipoiymerase(KahRa公司）说明书进 行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析结果显示扩增产物为预期的73化P;将PCR产物插入 pamttle-CMV的化oI/Hindlll位点，获得重组载体pShuttle-GFP。
[0068] (2)按照A祀asy?AdenoviralVectorSystem(AgilentTechnologies)说明书 和文献炬enihoudK,YehP,Perricaudet,M.Adenovirusvectorsforgenedelivery. QirrentOpinioninBiotechnology, 1999, 10 巧）：440-447)制备重组腺病毒rAd-GF