检测发现该少突胶质细胞具有诱导放电功能，成功得到诱导的少突胶质细胞，是 一种可行性比较高的方法。然而，该专利文献没有公开如何有效地将MSC定向诱导分化为 少突胶质细胞，并且如何将MSC有效地定向诱导分化为少突胶质细胞的研究在其它现有技 术中也非常少。
【发明内容】
[0016]为克服现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种将厮带间充质干细胞 诱导分化成少突胶质细胞的方法，本发明还设及培养得到的少突胶质细胞。
[0017] 为此，本发明提供了如下方法，该方法包括如下步骤： (1)、厮带间充质干细胞的培养和扩增；获得厮带间充质干细胞单体，将厮带间充质 干细胞单体按l-5X105/ml接种于厮带间充质干细胞培养液中，在35-38°C、体积分数为 5-10%的C〇2饱和湿度培养箱内培养，每3-8天换液传代一次，得到培养的细胞； 所述厮带间充质干细胞培养液含DMEM/F12基本培养基，2%B27 (重量)，2-4mMk谷 氨酷胺，ImM硫代甘油，EGF20-40ng/ml，bFGF20-30ng/ml，80-90U/ml青霉素，60-70yg/ ml链霉素。优选地，所述培养液中可W加入非必需的氨基酸，其含量可W为1-2% (重量)， 更优选1 % (重量)。
[001引 （2)、预诱导分化；将步骤（1)得到的培养细胞按1~5XlOYml的细胞密度接种 进行贴壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天 时终止诱导；其中在该步骤的培养过程中，在培养液中添加皂巧类诱导物，并且保持培养液 中所述诱导物的浓度为5-10yg/mL; 在步骤（1)中，所述体积分数为5-10%的C02饱和湿度培养箱在本领域中也通常可称 作5-10%C02培养箱。
[0019] 所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nM~50nM的维 生素C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，15-25yg/LbFGF，15-化yg/LEGF，l-8mMレ谷氨酷 胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100yg/ml链霉素，所述预诱导培养液另外任 选含有0. 01M磯酸盐缓冲液（PBS)，即含有0. 01M磯酸盐进行缓冲。
[0020] 所述皂巧类诱导物的神经性活性在W前没有报导，本发明人经过研究发现，其可 促进干细胞向少突胶质细胞的分化，并且可促进干细胞表达与神经生长、分化有关的如 NGF、NT-3和抓NF等细胞因子，该些细胞因子能诱导干细胞向少突胶质细胞定向分化，同 时能够抑制向星形角质细胞AST的分化。
[0021] 在一个最优选的实施方式中，为了促进厮带间充质干细胞向少突胶质细胞分化的 有效性例如分化效率和选择性，本发明人经过大量筛选、分离、分析和提纯获得了下文结构 式（I)~（III)所示的皂巧类物质，发现其能够使得厮带间充质干细胞向少突胶质细胞分 化的效率和选择性得到明显提高。换言之，本发明人经过大量试验和复杂的结构分析和筛 选，提供具有如下结构式（I)~（III)任一种所示的皂巧类物质；
【主权项】
1. 一种将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法，其特征在于该方法包括 以下步骤： (1) 脐带间充质干细胞的培养和扩增：获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质 干细胞单体按l-5X105/ml接种于脐带间充质干细胞培养液中，在35-38°C、体积分数为 5-10%的0)2饱和湿度培养箱内培养，每3-8天换液传代一次，得到培养的细胞；其中所述脐 带间充质干细胞培养液含DMEM/F12基本培养基，2%B27, 2-4mML-谷氨酰胺，ImM硫代甘 油，EGF20-40ng/ml，bFGF20-30ng/ml，80-90U/ml青霉素，和 60-70yg/ml链霉素；以及 (2) 预诱导分化：将步骤⑴得到的培养细胞按1~5XIO4Ail的细胞密度接种进行贴 壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天时终止 诱导；其中在该步骤的培养过程中，在培养液中添加皂苷类诱导物，并且保持培养液中所述 诱导物的浓度为5-10yg/mL;并且，其中所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此 基础上还含有20nM~50nM的维生素C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，15-25yg/LbFGF， 15-25yg/LEGF，l-8mML-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100μg/ml 链霉素，所述预诱导培养液另外任选含有〇.OlM磷酸盐进行缓冲。
2. 根据权利要求1所述的将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法，其 特征在于：该方法还包括步骤⑶诱导分化：将步骤⑵得到的细胞按1~5XIOVml的细 胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量 换液，第3-6天时终止诱导，得到少突胶质细胞；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基， 在此基础上还含有20nmol~50nmol的维生素C，30nM~40nM的维生素Bl，0. 01-0. 02 %的 二甲基亚砜，0.ImM2-0 -巯基乙醇，10-20U/ml人白细胞抑制因子，10-30U/ml碱性成纤维 细胞生长因子，l_8mML-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，和80-100μg/ml 链霉素。
3. 根据权利要求1或2所述的将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法， 其特征在于：所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12, 2%B27,4mML-谷氨酰胺，ImM硫 代甘油，EGF20ng/ml，bFGF20ng/ml，90U/ml青霉素，70yg/ml链霉素；所述预诱导培养液 为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，20U/ml人白细胞抑制因 子，8mML-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，80U/ml青霉素，80yg/ml链霉素；所述诱导培养液为 DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有50nmol的维生素C，30nmol的维生素B1，0. 01% 的二甲基亚砜，0.lmM2-0 -巯基乙醇，10U/ml人白细胞抑制因子，30U/ml碱性成纤维细胞 生长因子，8mML-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，lOOU/ml青霉素，lOOyg/ml链霉素。
4. 根据权利要求1或2所述的将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法， 其特征在于：在所述步骤（2)中，培养液的pH维持在7. 1-7. 7。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述皂苷类诱导物衍生自天然来源。
6. 根据权利要求1-5任一项所述的方法培养得到的少突胶质细胞。
【专利摘要】公开了将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法。该方法采用预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，其中通过加入皂苷类化合物作为诱导物，成功诱导脐带间充质干细胞分化成少突胶质细胞，并且分化比例较高。
【IPC分类】C12N5-0775, C12N5-079
【公开号】CN104774807
【申请号】CN201510207336
【发明人】安沂华, 董健伸
【申请人】安沂华
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月28日