的药物相差甚远，因此本试验的阳性对照药选用已上市的奥利司他。
[0120] 二、材料与方法
[0121] 1.供试物
[0122] LZ-31，其为本发明实施例2制备的化合物（2b)。
[0123] 2.动物的喂养
[0124] 选取昆明种小鼠（雄雌各半）40只，体重20 ± 2g，购自湖南省天勤生物技术有限公 司（SCXK(湘）2014-0010号）。实验动物按分笼饲养，饮水采用本市自来水，经高压蒸汽灭 菌后使用。饲养环境温度控制在20±3°C，相对湿度60%~70%，每天12h日光与12h黑 暗交替，工作照度为150LX~300LX，清洁卫生按本实验室有关标准操作规程要求进行，试 验前常规检疫1周。试验期间小鼠自由摄食饮水，连续喂养36d。复合饲料购从湖南天勤 生物技术有限公司（SCXK(湘）2014-0011号）；高脂饲料购从北京科澳协力饲料有限公司 (SCXK (京）2009-0012 号）。
[0125] 3.受试动物的分组与处理
[0126] 将40只昆明小鼠（雄雌各半）随机分为对照组、模型组、受试样品LZ-31组和减 肥药奥利司他给药组4组，每组10只。
[0127] 对照组：小鼠从试验开始到试验结束采用全价配合饲料喂养，每天经口灌胃1% 羧甲基纤维素钠（灌胃体积〇. 3mL/只）。
[0128] 高脂血症组：小鼠从试验开始到试验结束只喂养高脂饲料，高脂饲料购自北京科 澳协力饲料有限公司，每天每只经口灌胃1%羧甲基纤维素钠（灌胃体积〇.3mL/只）。
[0129] 受试样品LZ-31组：小鼠从试验开始到试验结束只喂养高脂饲料，且每天经口 灌胃给药受试样品LZ-31200mg/kg ; (3mL 1 %羧甲基纤维素钠的水乳剂加入受试样品 LZ-3150mg，灌胃体积 0· 3mL/ 只）。
[0130] 奥利司他给药组：小鼠从试验开始到试验结束只喂养高脂饲料，且每天经口灌胃 给药奥利司他200mg/kg ; (3mL 1 %羧甲基纤维素钠的水乳剂加入奥利司他50mg，灌胃体积 0· 3mL/ 只）。
[0131] 正式试验记录每天每只小鼠的平均饲料摄入量记录每天每只小鼠的平均饲料摄 入量，每隔3天准确称取小鼠体重，试验起始及实验结束时测量每只小鼠体长（从鼻尖到肝 门的长度）。
[0132] 各组小鼠在测完体重和体长之后，禁食24小时。于实验第36天，在眼底静脉丛摘 眼球采血，血液静置30min后，3000r/min离心15min，分离血清备测。
[0133] 4.检测项目与指标
[0134] 按照酶法试剂盒要求的测定条件和程序测定血清总胆固醇（TC)，甘油三脂（TG)， 高密度脂蛋白（HDL-C)和低密度脂蛋白（LDL-C)含量。
[0135] 5.主要实验仪器及试剂：
[0136] 主要仪器：
[0137] AEL-120电子分析天平，Spectrum紫外可见分光光度仪，TDZ5-WS低速离心机， TGL-16G离心机等。
[0138] 试剂：
[0139] 羧甲基纤维素：购自北京鼎国生物技术有限责任公司，sigma分装；
[0140] 参比药物奥利司他胶囊：购自长沙市湘雅路老百姓大药房（商品规格：0. 12gX 18 粒，原料纯度：99%，批准文号：国药准字H20123131，重庆植恩药业有限公司生产；
[0141] 血清总胆固醇（TC，酶偶联比色法），甘油三脂（TG，酶偶联比色法），高密度脂蛋白 (HDL-C，液体沉淀分离法）和低密度脂蛋白（LDL-C，选择性沉淀法）含量测定试剂盒购自南 京建功生物工程研宄所。
[0142] 6.试验数据统计处理：
[0143] 试验数据采用SPSS 19. Ofor Windows软件进行统计处理，组间均数比较采用t检 验，P < 0. 05,认为其差异有统计学意义。
[0144] 7.实验质量控制
[0145] (1)试验计划由项目负责人起草，并由项目组讨论，审核确定后进行实施。
[0146] (2)按试验计划及本试验室制定的SOP要求进行动物试验。试验废弃动物及尸体 按本实验室SOP要求进行卫生处理。
[0147] (3)每周由项目负责人抽查试验工作质量与试验动物饲养情况1次。
[0148] (4)每周由项目负责人或质量监督员抽查原始记录1次。
[0149] 三、试验结果
[0150] 1.小鼠的体长
[0151] 小鼠体长均有增长，各实验组体长差异无统计学意义（表1)
[0152] 表1昆明小鼠体长测定结果（cm，η = 10, X土SD)
[0153]
[0154] 2.动物进食量的变化
[0155] 表2试验期间动物进食量测定结果（g，η = 10, X土SD)
[0156]
[0158] 3.小鼠的体重变化
[0159] 试验期间小鼠体重均有增长，从试验第22d起至试验结束，高脂血症模型组小鼠 体重明显高于对照组，其差异有统计学意义（P值均< 0. 05)，从给药第22d起至试验结束， 高脂血症模型组小鼠体重明显高于LZ-31给药组，其差异有统计学意义（P值均<0.05)，从 试验第22d起至试验结束，高脂血症模型组小鼠体重明显高于奥利司他给药组，其差异有 统计学意义（P值均< 〇. 05)，从试验第Id起至试验结束，对照组、奥利司他给药组及LZ-31 给药组间小鼠体重比较，其差异无统计学意义（结果见表3)。
[0160] 表3各试验组小鼠体重测定结果（g，η = 10, X土 SD)
[0161]
[0162] 注：*表示与高脂血症模型组比较P < 0. 05
[0163] 4.动物血脂变化
[0164] 如表4所示，实验第36天测定实验动物的血清总胆固醇（TC)，甘油三酯（TG)，高 密度脂蛋白（HDL-C)和低密度脂蛋白（LDL-C)的水平，结果显示：高脂血症模型组TC水 平高于对照组、LZ-31给药组和奥利司他给药组，其差异有统计学意义（P值均< 0. 05)， 且LZ-31给药组、奥利司他给药组TC水平显著低于对照组，其差异有统计学意义（P值均 < 〇. 05);高脂血症模型组TG水平高于对照组、LZ-31给药组和奥利司他给药组，其差异有 统计学意义（P值均< 〇. 05)，LZ-31给药组、奥利司他给药组TG水平显著低于对照组，其差 异有统计学意义（P值均< 〇. 05);高脂血症模型组、LZ-31给药组和奥利司他给药组LDL-C 水平显著高于对照组，差异有统计学意义，但高脂血症模型组、LZ-31给药组和奥利司他给 药组间LDL-C水平差异无统计学意义（P值均>0.05);各实验组之间HDL-C水平差异无统 计学意义（P值均> 0.05)。
[0165] 表4昆明小鼠降脂疗效测定结果（η = 10, X土SD)
[0166]
[0167] 注：* :与高脂血症模型组比较P < 0. 05 ; t:与对照组比较P < 0. 05 ; t:与高脂血 症模型组比较P < 0. 05 ;# :与对照组比较P < 0. 05 ; § :与对照组比较P < 0. 05
[0168] 四、结论
[0169] 本试验成功构建了小鼠高脂血症模型，在本试验条件下，给药36天，给药36天，受 试样品LZ-31可降低TC，TG的水平，增加 HDL-C水平，降低小鼠体重，其效果与参比药物奥 利司他接近，在降低小鼠体重的功效方面甚至优于奥利司他，但受试样品LZ-31不影响动 物的进食量，对小鼠的体长没有影响，也不能降低LDL-C水平。
【主权项】
1. 一种多不饱和脂肪酰磷脂衍生物，该衍生物的结构通式如下：其中，m= 5 或 6;n= 2,3 或 5;k= 2,3,4,5 或 6。2. 根据权利要求1所述的多不饱和脂肪酰磷脂衍生物，其特征在于该衍生物包括如下 化合物： (0, 0)-二异丙基-[0-(二十二碳六烯酰基-2-乙醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十二碳六烯酰基-3-丙醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十二碳六烯酰基-4- 丁醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十二碳六烯酰基-5-戊醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十二碳六烯酰基-6-己醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十碳五烯酰基-2-乙醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十碳五烯酰基-3-丙醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十碳五烯酰基-4- 丁醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十碳五烯酰基-5-戊醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十碳五烯酰基-6-己醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十二碳五烯酰基-2-乙醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十二碳五烯酰基-3-丙醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十二碳五烯酰基-4- 丁醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十二碳五烯酰基-5-戊醇胺基）]-亚磷酸脂； (0, 0)-二异丙基-[0-(二十二碳五烯酰基-6-己醇胺基）]-亚磷酸脂。3. 如权利要求1所述多不饱和脂肪酰磷脂衍生物的制备方法，其特征在于该方法包括 以下步骤：将多不饱脂肪酸和磷酰化醇胺混合均匀，在酯缩合剂的作用下，制备得到多不饱 和脂肪酰磷脂衍生物；所述的酯缩合剂包括N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺和草酰氯。4. 如权利要求3所述多不饱和脂肪酰磷脂衍生物的制备方法，其特征在于，所述的多 不饱和脂肪酸选自二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳五烯酸中的一种；所述的磷 酰化醇胺选自磷酰化乙醇胺、磷酰化丙醇胺、磷酰化丁醇胺、磷酰化戊醇胺和磷酰化己醇胺 中的一种。5. 如权利要求3所述多不饱和脂肪酰磷脂衍生物的制备方法，其特征在于，所述的酯 缩合剂为N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺和草酰氯按体积用量比为（1.2-1. 6) : (3. 0-4.8): (0. 8-1. 4)配制的二氯甲烷混合溶液。6. 如权利要求5所述多不饱和脂肪酰磷脂衍生物的制备方法，其特征在于，该方法是 将多不饱脂肪酸和磷酰化醇胺混合均匀，在酯缩合剂的作用下，于〇°C下搅拌反应l_3h，得 到多不饱和脂肪酰磷脂衍生物。7. -种多不饱和脂肪酰磷脂衍生物的精制方法，其特征在于，取权利要求3所述方法 制备的反应物，加入饱和碳酸钠溶液，以二氯甲烷萃取1-5次，萃取液经干燥，浓缩，然后先 后上硅胶柱层析、高效液相制备色谱纯化，收集特征保留时间的组分，即得多不饱和脂肪酰 磷脂衍生物精品；所述硅胶柱层析的流动相为体积比1 : 2的乙酸乙酯-石油醚溶液；所述 高效液相制备色谱的流动相为体积比95 : 5的甲醇-水溶液。8. 如权利要求7所述多不饱和脂肪酰磷脂衍生物的精制方法，其特征在于，所述高效 液相制备色谱的型号为AgilentXDB-C18Z0RBAX，流速20ml/min，所述的特征保留时间为 t1/2= 5. 5-11.Omin〇9. 如权利要求1或2所述的多不饱和脂肪酰磷脂衍生物在制备降低血清总胆固醇、甘 油三酯或/和提高高密度脂蛋白的药物、保健品或食品中的应用。10. 如权利要求1或2所述的多不饱和脂肪酰磷脂衍生物在制备调节饮食失调或/和 治疗超重或肥胖的药物、保健品或食品中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种多不饱和脂肪酰磷脂衍生物及其制备方法与应用，该衍生物的结构通式如下：其中，m＝5或6；n＝2，3或5；k＝2，3，4，5或6；其是将多不饱脂肪酸和磷酰化醇胺混合均匀，在酯缩合剂的作用下制得。本发明不但具有抑制脂肪吸收，促进脂肪水解的功能，而且还能促进脂肪水解并防止脂肪堆积，同时不影响患者的食欲，可被开发成降低血脂、调节饮食失调、治疗超重或肥胖等营养性疾病的药物。
【IPC分类】C07F9/24, A61K31/664, A61P3/04, A61P3/06, A23L1/30
【公开号】CN104910206
【申请号】CN201510204484
【发明人】方华, 黄晓燕, 陈伟珠, 谢全灵, 张怡评, 洪专
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年4月27日