H20 lg、FeCl3 0.005g、蒸馏水 1000mL，pH 7.4。将种子罐种子液接种于发酵基础培养基中，装料系数0.8，121°C蒸汽灭菌20分钟，接种量10%，培养温度330C，pH值7.2，通气量1: 1.2 (v/v.min)，以搅拌转速控制溶氧饱和度DO值30%，以植物油为消泡剂控制泡沫；每间隔4小时取一次样，立即作镜检观察菌数及菌体形态，化验糖、氨态氮；根据检验结果适时补料，控制糖剂量为3g/L、以NH4Cl控制氮源0.lg/L,培养28小时停止补料，30小时时菌体达到2.4X 19 cfu / mL。
[0024](5)第二阶段发酵培养控制37°C，pH值8.9，通气量为1: 0.8 (v/v.min)，以搅拌转速控制溶氧饱和度DO值10%，加入0.lg/L碳酸钙，促进芽孢形成，每间隔4小时取样，立即作镜检观察菌体形态，当镜检视野中的菌体形态全部芽孢时即为发酵终点，停止发酵，最终发酵周期为32小时，芽孢数为1.6X 109cfu/mL。芽孢转化率83%。
[0025]实施例5
胶质芽孢杆菌mucilaginosus HSCUP-76-8)高密度发酵工艺，其步骤同实施例3，各步骤的培养基和培养条件有所不同；分别是:
(I)菌种活化与种子扩大培养的培养基是:蔗糖2g、NaH2PO4 lg、MgSO4.7H20 0.2g、FeCl3 0.005g、CaCO3 0.0lg、琼脂30g，蒸馏水lOOOmL，pH 7.3。培养条件是:温度控制在32°C，培养40小时。
[0026](2)摇瓶培养的培养基是:蔗糖 5g、NH4Cl Ig、NaH2PO4 lg、MgSO4.7H20 lg、FeCl30.005g、CaC03 0.3g、蒸馏水1000mL，pH 7.3。培养条件是:在250mL的容器中装入50mL的摇瓶培养基，摇床培养温度30°C、转速200r/min、培养时间10小时。
[0027](3)种子罐培养的培养基是:鹿糖2g、淀粉10g、NH4Cl 0.5g、酵母浸粉2g、NaH2P04lg、MgSO4.7H20 lg、FeCl3 0.005g、蒸馏水1000mL，pH 7.3。将种子液接种于种子罐培养基，装料系数0.75，121°C蒸汽灭菌20分钟，接种量8%，培养温度31°C，通气量为1.0:0.9(v/v.min)，通过调节搅拌转速控制溶氧饱和度DO值25%，pH控制在7.1，培养10小时。
[0028](4)第一阶段发酵培养的培养基是:玉米粉5g、NH4Cl lg、酵母浸粉lg、NaH2PO42g、MgS04.7Η20 0.5g,FeCl3 0.005g、蒸馏水1000mL，pH 7.2。将种子罐种子液接种于发酵基础培养基中，装料系数0.75，121°C蒸汽灭菌20分钟，接种量6%，控制参数:温度32°C，pH值7.2，通气量1:1 (v/v - min),以搅拌转速控制溶氧饱和度DO值28%，以植物油为消泡剂控制泡沫；每间隔4小时取一次样，立即作镜检观察菌数及菌体形态，化验糖、氨态氮；根据检验结果适时补料，控制糖剂量为2.5g/L、以NH4Cl控制氮源0.3g/L，接近对数生长末期时停止补氮，此时，在显微镜视野中出现少数短粗状细胞为特征，培养28小时停止补料，30小时时菌体达到2.4X 19 cfu / mL。
[0029](5)第二阶段发酵培养控制35。。，pH值7.6，通气量为I: 0.9 (v/v.min),以搅拌转速控制溶氧饱和度DO值8%，加入0.lg/L碳酸钙，促进芽孢形成，每间隔4小时取样，立即作镜检观察菌体形态，当镜检视野中的菌体形态全部芽孢时即为发酵终点，停止发酵，最终发酵周期为32小时，芽孢数为1.6X 109cfu/mL。芽孢转化率81%。
【主权项】
1.一株胶质芽抱杆菌(Bacillus muci laginosus) HSCUP-76-8，其特征是已于2013年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCN0.848102.根据权利要求1所述的胶质芽孢杆菌(Bacillus其特征是所述的胶质芽孢杆菌HSCUP-76-8原始菌株分离自山西省和顺钾页岩山洞岩床，将该菌株进行紫外诱变和等离子诱变处理后获得，经过革兰氏染色，芽孢染色，荚膜染色，鞭毛染色，电子显微镜观察及其他生理生化特性的测定，最后经过16SrDNA序列的比对分析，鉴定为胶质芽抱杆菌，定名Bacillus muci laginosus HSC。3.胶质芽孢杆菌(Bacillusmuci laginosus) HSCUP-76-8高密度发酵方法，包括如下步骤: (1)菌种活化与斜面种子培养将胶质芽孢杆菌HSCUP-76-8接种于斜面培养基进行活化，温度控制在29-33?，培养24-48小时，得到原始斜面种子，再将原始斜面种子接种于斜面培养基，相同条件培养，得生产斜面种子备用； (2)摇瓶培养将生产斜面种子接种于摇瓶培养基中，在200-500mL的容器中装入20%-45%的摇瓶培养基，摇床培养温度29-33°C、转速160_220r/min、培养时间8_12小时，得种子液备用； (3)种子罐培养将种子液接种于种子罐培养基，装料系数0.7-0.8，121°C蒸汽灭菌20分钟，接种量5%-10%，培养温度29?33°C，通气量为1.0:0.8-1.0 (v/v.min)，通过调节搅拌转速控制溶氧饱和度DO值10%?30%，pH控制在7.2±0.2，培养8?12小时，获得对数生长期种子液，在显微镜视野中细胞呈细长形，表现为着色力强，备用； (4)第一阶段发酵培养将种子罐种子液接种于发酵基础培养基中，装料系数0.7-0.8，121 °C蒸汽灭菌20分钟，接种量5%?10%，控制参数:温度29?33 °C，pH值7.0-7.2，通气量1:0.8-1.2 (v/v.min)，以搅拌转速控制溶氧饱和度DO值20%?30%，以植物油为消泡剂控制泡沫；每间隔4小时取一次样，立即作镜检观察菌数及菌体形态，化验糖、氨态氮；根据检验结果适时补料，控制糖剂量为2g/L?3g/L、以NH4Cl控制氮源0.5g/L?0.lg/L，接近对数生长末期时停止补氮，此时，在显微镜视野中出现少数短粗状细胞为特征； (5)第二阶段发酵培养控制参数:温度33~37°C，pH值7.2?8.9，通气量为1:1.0-0.8 (v/v.min),以搅拌转速控制溶氧饱和度DO值5%?10%，加入0.lg/L碳酸钙，促进芽孢形成，每间隔4小时取样，立即作镜检观察菌体形态，当镜检视野中的菌体形态全部芽孢时即为发酵终点，停止发酵，贮存备用。4.根据权利要求3所述的胶质芽孢杆菌HSCUP-76-8高密度发酵方法，其特征在于，所述的斜面培养基的组成成分为:蔗糖2~5g、NaH2P04 0.5~lg、MgS04.7H20 0.2-0.5g、FeC13 0.005g、CaCO3 0~0.lg、琼脂 20~30g，蒸馏水 1000mL，pH 7.0~7.4。5.根据权利要求3所述的胶质芽孢杆菌HSCUP-76-8高密度发酵方法，其特征在于，所述的摇瓶培养基的组成成分为:蔗糖5~10g、NH4Cl 0.5~lg、NaH2PO4 1-1.5g、MgSO4.7H200.5~lg、FeCl3 0.005g、CaCO3 0.1-0.3g、蒸馏水 1000mL，pH 7.0-7.4。6.根据权利要求3所述的胶质芽孢杆菌HSCUP-76-8高密度发酵方法，其特征在于，所述的种子罐培养基的组成成分为:蔗糖2~5g、淀粉3~10g、(NH4)2SO4 l~2g/ NH4Cl 0.5~lg、酵母浸粉 I?2g、NaH2PO4 1-1.5g、MgSO4.7H20 0.5?lg、FeCl3 0.005g、蒸馏水 lOOOmL，pH7.0-7.4o7.根据权利要求3所述的胶质芽孢杆菌HSCUP-76-8高密度发酵方法，其特征在于，所述的发酵基础培养基的组成成分为:蔗糖5g、(NH4)2SO4 l~2g/ NH4Cl 0.5~lg、酵母浸粉I?2g、NaH2PO4 I?2g、MgSO4.7H20 0.5?lg、FeCl3 0.005g、蒸馏水 1000mL，pH 7.0?7.4 ;所述的蔗糖可以用同等糖量的玉米粉和/或淀粉代替。
【专利摘要】本发明公开了一株胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）HSCUP-76-8，其特征是已于2013年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.8481。本发明还公开了胶质芽孢杆菌HSCUP-76-8高密度发酵的方法。本发明的胶质芽孢杆菌HSCUP-76-8，发酵时间在30～48小时内的芽孢数能达到1.6×109 cfu/mL～2.0×109 cfu/mL，芽孢转化率为75%~83%，解钾能力强达到2.6ug/mL。CGMCC No.848120131119
【IPC分类】C12N3/00, C12N1/20, C12R1/07
【公开号】CN104928203
【申请号】CN201410324943
【发明人】牧耀贵, 赵良啟, 秦文旺, 吕利华, 李瑞强, 陈绮
【申请人】山西绿图生物科技有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2014年7月9日