碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学与材料领域，涉及一种碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 分子印迹技术是一种模拟抗原-抗体相互作用，采用人工合成方法获得空间结构 和结合位点与模板分子相匹配的聚合物的技术。首先，模板分子与功能单体之间产生互补 的相互作用形成复合物，然后在交联剂作用下，在模板-单体复合物周围发生本体聚合反 应形成聚合物，最后在一定条件下除去聚合物中的模板分子，即可得到具有与模板分子匹 配的特定空间结构空穴和识别位点的选择性分子识别材料，即通常所说的分子印迹聚合 物。与天然的生物大分子识别系统相比，合成的分子印迹聚合物有着构象预定性、特异识别 性、长期稳定性以及实施简便性等优点，已被广泛用于色谱分离、固相萃取、模拟酶催化以 及传感器等诸多领域。然而，由于作为印迹模板的蛋白质本身存在体积庞大、结构复杂、可 结合位点多以及构象不稳定等问题，迄今为止，针对蛋白质等生物大分子的印迹仍然面临 着巨大挑战。
[0003] 表面分子印迹技术是最近发展起来的一种构建在基质表面上的分子印迹方法。该 方法是在聚合溶液中引入基质或将聚合溶液涂覆在基质上，使模板分子和功能单体的聚合 反应发生在基质表面以形成分子印迹聚合物薄膜，从而使分子识别位点暴露在基质表面。 表面分子印迹技术可以克服传统包埋法存在的空间位阻大的问题，使模板分子能够自由地 进出基质表面聚合物中的特异性识别位点。同时，由于基质具有较强的机械稳定性，因此可 以有效调节聚合物的强度以适应实际应用的需要。以碳纳米管为基质，采用预组装或自组 装的方法对其表面进行修饰，然后在其表面接枝一层分子印迹聚合物薄膜，可以制备出一 系列具有不同识别位点和空腔结构的碳纳米管表面分子印迹聚合物，从而解决蛋白质分子 印迹聚合物合成和识别中存在的技术问题。
[0004] 离子液体是由有机阳离子和无机阴离子组成的在室温或近于室温下呈液态的有 机盐，具有无毒、低温不挥发、对水和空气稳定、溶解性好、稳定性高、极性强、成膜性能好以 及易于改性的优点。离子液体由于分子结构和化学性质的独特性，在分离科学领域的应用 很广，如用作液液萃取的溶剂，固相萃取的吸附剂、色谱柱的涂层材料以及分子印迹聚合物 的致孔剂、助溶剂和功能单体。在众多离子液体中，咪唑型离子液体是研宄最多也是应用 最广的离子液体。由于咪唑离子液体具有特殊的咪唑阳离子和无机阴离子结构，在与蛋白 质等生物大分子复合时可以提供较强的与之互补的多重相互作用，包括静电、氢键和π -π 堆积作用。N-叔丁基丙烯酰胺在分子印迹聚合物的制备和识别过程中能够提供较强的疏水 相互作用。因此，以亲水性的离子液体以及疏水性的N-叔丁基丙烯酰胺为混合功能单体， 通过调节两种功能单体的配比以得到与模板蛋白质在空间结构和作用力上高度匹配的分 子印迹聚合物，应用前景良好。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物及其制备方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 本发明所提供的碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物，它是以溶菌酶为模板分 子，1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体和N-叔丁基丙烯酰胺为混合功能单体，丙烯 酰胺修饰碳纳米管为基质，PH9的Tris-HCl缓冲溶液为反应体系，在交联剂、引发剂和催化 剂作用下制得的对溶菌酶具有选择性识别能力的表面分子印迹聚合物。
[0008] 优选地，所述丙烯酰胺修饰碳纳米管、溶菌酶、N-叔丁基丙烯酰胺、1-烯丙 基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体的重量比依次为（20~40) : (15~25) : (30~ 120) : (160 ~400)〇
[0009] 进一步优选地，所述丙烯酰胺修饰碳纳米管、溶菌酶、N-叔丁基丙烯酰胺、1-烯丙 基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体的重量比依次为30 : 18 : (80~100) : (180~220)。 [0010] 优选地，所述交联剂为Ν，Ν' -亚甲基双丙烯酰胺。
[0011] 进一步优选地，所述交联剂与丙烯酰胺修饰碳纳米管的重量比为3.3~5 : 1。
[0012] 优选地，所述引发剂为过硫酸铵。
[0013] 优选地，所述催化剂为Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基乙二胺。
[0014] 本发明进一步提供一种制备碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物的方法，它包括 以下步骤：
[0015] 1)将15~25mg溶菌酶溶于30mL ρΗ9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入30~120mg N-叔丁基丙烯酰胺和160~400mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力 搅拌2h ;
[0016] 2)加入20~40mg丙稀酰胺修饰碳纳米管，超声分散均勾，加入60~200mg Ν，Ν' -亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15-20分钟；
[0017] 3)加入20-4011^过硫酸铵，50-10(^1^^^州'-四甲基乙二胺，继续通氮气除 氧15-20分钟，然后在无氧条件下常温磁力搅拌12-48h ;
[0018] 4)将固液两相分离，对固相产物采用pH9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤3-5次，再用 超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，即得。
[0019] 优选地，所述方法包括以下步骤：
[0020] 1)将18mg溶菌酶溶于30mL pH9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入80~IOOmg N-叔 丁基丙烯酰胺和180~220mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌 2h ；
[0021] 2)加入30mg丙稀酰胺修饰碳纳米管，超声分散均勾，加入100~150mg N, Ν' -亚 甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15-20分钟；
[0022] 3)加入40mg过硫酸铵，50 μ L Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15-20 分钟，然后在无氧条件下常温磁力搅拌12-48h ;
[0023] 4)将固液两相分离，对固相产物采用pH9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤3-5次，再用 超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，即得。
[0024] 优选地，所述丙烯酰胺修饰碳纳米管是对羧基化碳纳米管进行表面化学修饰得 到的，所述羧基化碳纳米管的管径< 8nm，长度为20~30 μ m，羧基含量为3. 86wt %，纯度 >95%，表面化学修饰的方法是：称取0. 6g羧基化碳纳米管，加入60mL二氯亚砜和10滴二 甲基甲酰胺，70°C回流24h，溶剂蒸干后，继续加入3g丙烯酰胺和50mL二甲基甲酰胺，超声 溶解lOmin，于45°C回流24h，产物用超纯水洗至中性，60°C烘干。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] 1)由于引入了极性的1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体和疏水性的N-叔 丁基丙烯酰胺两种功能单体，使得模板分子与功能单体复合时作用位点更多，作用力更强， 在分子印迹聚合物的制备过程中可以形成更有效的识别位点。因此，对溶菌酶的印迹效果 和选择性吸附能力比只以离子液体为功能单体制备的分子印迹聚合物更好。
[0027] 2)由于碳纳米管的比表面积大，机械强度高，形成的印迹薄膜铺展于碳纳米管的 表面，呈现出多孔的网状结构，使暴露在表面的印迹位点更多，空间位阻更小，模板分子洗 脱更完全，吸附更迅速，印迹效果更好，选择性吸附能力更强。
[0028] 3)由于聚合反应在pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中进行，溶菌酶表面暴露的带负电 荷氨基酸能够与离子液体的咪唑阳离子通过静电、氢键和：π-π堆积作用形成稳定性更高 的复合物，从而在碳纳米管表面形成更多对溶菌酶具有特异性识别能力的有效印迹位点。
[0029] 以上这些优良的性能使其在溶菌酶识别、分离和纯化领域具有很好的应用前景， 同时也为解决其它蛋白质分子印迹聚合物合成和识别中存在的问题奠定了基础。
【附图说明】
[0030] 图1 :实施例1-11碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物合成路线示意图。
[0031] 图2 :实施例12-19碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物合成路线示意图。
[0032] 图3 :1_烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸功能单体含量对碳纳米管表面溶菌酶分子 印迹聚合物和空白分子印迹聚合物吸附效果的影响曲线图。
[0033] 图4 :1_烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸功能单体含量不同的分子印迹聚合物和 空白分子印迹聚合物的扫描电镜图。（a)功能单体200mg分子印迹聚合物；(b)功能单体 200mg空白分子印迹聚合物；（c)功能单体300mg分子印迹聚合物；（d)功能单体300mg空 白分子印迹聚合物。
[0034] 图5 :Ν，Ν' -亚甲基双丙烯酰胺交联剂含量不同的分子印迹聚合物和空白分子印 迹聚合物对溶菌酶的吸附量（以1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸为功能单体的聚合体 系）。