AA-3' Site9:5' -AACTATACA(biotin)ACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTC AA-3' Sitel4:5' -AACTATACAACCTA(biotin)CTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTC AA-3' Sitel8:5' -AACTATACAACCTACTAC(biotin)CTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTC AA-3' 在冰上配制A和B反应液： A反应液包含：Nt. BstNBI缓冲液、site 2模板、dNTP、RNase抑制剂、let_7a、链酶亲和 素，其中链酶亲和素SA可与扩增模板上的biotin结合。
[0028] B反应液包含：聚合酶缓冲溶液、Vent (exo_)聚合酶、Nt. BstNBI切口酶、SYBR Green I荧光染料，其中Nt. BstNBI切口酶可识别DNA双链中的切口酶识别序列，并在该位 点剪切形成一个切口。
[0029] 将AB反应液混合后在55°C进行扩增反应，并用stepone plus荧光定量PCR检测 扩增曲线。如图4所示，site 2模板的扩增曲线对应的P0I值最小，说明使用site 2模板 进行扩增的反应最灵敏，最迅速，故选择site 2模板作为最佳反应模板。
[0030] (2 ) miRNA测定条件优化 在冰上配制A和B反应液，A反应液包含Nt. BstNBI缓冲液、模板、dNTP、RNase抑制 剂、let-7a、链酶亲和素；B反应液包含聚合酶缓冲溶液、Vent (exo-)聚合酶、内切酶、SYBR Green I焚光染料。将AB反应液混合后在55°C进行扩增反应，并用stepone plus焚光定 量PCR检测扩增曲线。如图5所示，当聚合酶含量为0.05 U/yL，内切酶含量为0.4 U/yL 时，let-7a与空白的P0I差值最大，背景值最小，指数扩增反应的最佳条件。当模板量为 0. 1 y M时，扩增效率以及背景影响都较好，故选择模板量为0. 1 y M作为最优指数扩增模 板量。
[0031] 实施例3miRNA含量的测定 (1)标准曲线的获得 在冰上配制一系列不同浓度的let_7a待测溶液；根据最佳反应条件配制A和B溶液，A 溶液包含Nt. BstNBI缓冲液、site 2模板、dNTP、RNase抑制剂、let_7a、链酶亲和素；B溶液 包含聚合酶缓冲溶液、Vent (exo-)聚合酶、内切酶、SYBR Green I荧光染料。将A和B溶液 混合后定容至20 y L，所得最佳恒温指数扩增体系的组成为：0. 5 X Nt. BstNBI缓冲液（25 mMtris-HCl, pH 7. 90, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl, 0? 5 mM EDTA)、模板 site 2(0. 1 yM)、dNTP (250 yM)、RNase 抑制剂（0.8 U/yL)、let-7a、链酶亲和素 SA(0.2 yM)、lXThermoPol 聚 合酶缓冲溶液（lOmMKCl, 10 mM (NH4)2S04, 20 mMTris-HCl pH 8. 8, 2 mM MgS04, 0? 1% Triton X-100)、Vent (exo-)聚合酶（0.05 U/yL)、内切酶（0.4 U/yL)、0.4 X SYBR Green I 荧光染 料、DEPC水。然后在55°C进行指数扩增反应，在定量PCR仪上监控扩增曲线，求得P0I值，得 到 let_7a 浓度测定标准曲线。在 lpmol-1 fmol 之间，P0I =_ 2.8791ogclet7a - 32.29，R2 =0.9996 ;在 1 fmol 至 0.001 zmol 之间，P0I = - 1.9341ogclet7a - 18. 20，R2 = 0.9985。
[0032] (2)特异性验证 为了验证该改进指数扩增方法的特异性，配制一定浓度的let-7家族的其他miRNA (let_7b、let_7c、let_7d、let_7e、let_7g)溶液；在最佳反应条件下，在定量PCR仪上监控 扩增曲线（图7)，求得P0I值。
[0033] let-7a: 5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3'（SEQ ID NO. 1) let-7b: 5'-UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-3' (SEQ ID NO. 3) let-7c: 5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3' (SEQ ID NO. 4) let-7d: 5'-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGU-3' (SEQ ID NO. 5) let-7e: 5'-UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGU-3' (SEQ ID NO. 6) let-7g: 5'-UGAGGUAGUAGUUUGUACAGU-3' (SEQ ID NO. 7) 根据特异性计算公式，该方法对同族miRNA的特异性为：
(3)目标样品含量的测定 在一定量样品中提取出目标物后，在最佳反应条件下，在冰上分别配制A和B溶液。混 合A和B溶液后，立即在定量PCR仪上监控扩增曲线，求得P0I值，根据此P0I值，在标准曲 线上查出相应的的浓度。
[0034] 以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本 发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
【主权项】
1. 一种改进型恒温指数扩增模板，其包括3'端序列、5'端序列，以及3'端序列和5' 端序列之间的切口酶识别序列；所述3'端序列和5'端序列相同，均与待检核酸序列互补； 5'端序列至少有一个碱基上修饰有biotin。2. 根据权利要求1所述的改进型恒温指数扩增模板，其特征在于，优选在5'端序列 I-IObp的至少一个碱基上修饰biotin。3. 根据权利要求1所述的改进型恒温指数扩增模板，其特征在于，优选在5'端序列第 2个碱基上修饰biotin。4. 一种用于检测miRNA let-7a的恒温指数扩增模板，其序列为： 5'-AACTATACAACCTACTACCTCAAACAGACTCAAACTATACAACCTACTACCTCAA-3'，其第 1-23 bp 至少有一个碱基修饰有biotin。5. 根据权利要求4所述的用于检测miRNA let-7a的恒温指数扩增模板，其特征在于， 优选在其序列的第1-10 bp的至少一个碱基上修饰biotin。6. 根据权利要求4所述的用于检测miRNA let-7a的恒温指数扩增模板，其特征在于， 优选在5'端序列第2个碱基上修饰biotin。7. -种改进型恒温指数扩增试剂盒，其包括： (1) 恒温指数扩增模板：如权利要求1-6任一项所述； (2) DNA聚合酶； (3) 内切酶； (4) 链酶亲和素。8. 根据权利要求7所述的改进型恒温指数扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还 包括：dNTP、SYBR Green I荧光染料、酶缓冲液。9. 一种改进型恒温指数扩增技术，包括如下步骤： (1) 将恒温指数扩增模板、dNTP、RNase抑制剂、待检样品和链酶亲和素混合制成A反应 液； (2) 将DNA聚合酶、内切酶、SYBR Green I荧光染料混合制成B反应液； (3) 将A反应液和B反应液混合后进行指数扩增反应； (4) PCR仪上监控扩增曲线，求得POI值，根据建立的标准曲线求得目标核酸序列的浓 度。10. 根据权利要求9所述的改进型恒温指数扩增技术，其特征在于，指数扩增反应体 系含有：0.5XNt.BstNBI缓冲液、0.1 yM恒温指数扩增模板、250 yMdNTP、0.8 U/yL RNase抑制剂、待检样品、0. 2 yM链酶亲和素SAUXThermoPol聚合酶缓冲溶液、0. 05 U/ y L Vent (exo_)聚合酶、0.4 U/y L 切 口酶、0.4X SYBR Green I 荧光染料、DEPC 水；所述 0.5XNt. BstNBI 缓冲液含有：25 mMtris-HCl, pH 7.90,50 mM NaCl, 5 mM MgCl, 0.5 mM EDTA ;所述 I X ThermoPol 聚合酶缓冲溶液含有：10mMKCl，10 mM (NH4) 2S04, 20 mMTris-HCl pH 8. 8, 2 mM MgSO4, 0? 1% Triton X-100。
【专利摘要】本发明公开了一种改进型恒温指数扩增技术及其在microRNA检测中的应用。本发明通过在常规指数扩增模板的5’端与引物互补的区域内的一碱基上修饰一生物素来调节引物与扩增模板3’端和5’端的杂交速度，建立了改进型恒温指数扩增方法。该方法较常规恒温指数扩增方法，具有扩增效率更高，速度更快的优点，而且标准曲线的线性范围更宽，特异性更好，灵敏度更高。本方法具有很好的精确性，重复性和稳定性，可发展成为试剂盒并向市场推广。
【IPC分类】C12N15/10, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105039321
【申请号】CN201510383439
【发明人】戴宗, 陈俊, 邹小勇
【申请人】中山大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月1日