谱，先用石油醚：乙酸乙酯=20 :1溶剂冲洗，再用石油醚：乙酸乙酯=8 :1溶剂冲洗，收集 8 :1冲洗下来的部分，旋干，得到化合物A(l. Og);
[0051] (3)取化合物A(L Og)加入圆底烧瓶，再加入溴乙酸乙酯0· 4ml与碳酸钾0· 5g， 再加入乙腈，搅拌，升温至ll〇°C，回流24h，过滤，旋干溶剂，过硅胶柱色谱，先用石油醚冲 洗，再用石油醚：乙酸乙酯=20 :1溶剂冲洗；收集20 :1冲洗下来的部分，旋干，得到化合物 B (约 0.7g);
[0052] (4)向化合物B中加入THF 28ml，加入氢氧化钠2g(事先用12ml水溶解），反应 24h，旋干THF，用二氯甲烷溶解，再加入稀盐酸，萃取，取有机相，旋干，得到化合物C (0. 4g， TPE-C00H)；
[0053] (5)将多肽链的赖氨酸N端氨基与化合物C进行固相多肽合成反应，得到化合物 D即本实施例的荧光探针TPE-KFPE。将TPE-COOH和TPE-KFPE溶于HEPES (pH 7. 0)缓冲 液中分别制成浓度为10 μM的溶液，分别对两种溶液进行荧光光谱分析，设定激发波长为 320nm，得到光谱图如图2所示。
[0054] 从图2中可以看出，TPE-COOH在470nm处由于聚合诱导发光效应产生明显的荧光 吸收，而新合成的荧光探针TPE-KFPE则基本无荧光吸收。
[0055] 实施例2荧光探针TPE-KFPE在DPP-4活性检测中的应用
[0056] 荧光探针TPE-KFPE检测DPP-4活性
[0057] 样品组 I :加入 5 μ L TPE-KFPE (ImM);
[0058] 样品组 2 :加入 25 μ L DPP-4 (lOOmU/mL)、5 μ L TPE-KFPE (ImM);
[0059] 样品组 3 :加入 25 μ L DPP-4 (lOOmU/mL)、5 μ L TPE-KFPE (ImM)、2· 5 μ L 抑制剂 Diprotin A(ImM)；
[0060] 三个样品组均在37°C孵育下反应30min。反应结束后采用JASCO FP-6500分光光 度计测量320nm激发下，400nm到600nm的焚光光谱。
[0061] 检测结果如图3所示。
[0062] 由图3可见，DPP-4加入前，体系中仅含荧光探针，荧光强度较低；而DPP-4加入 后，体系的荧光强度急速上升；当体系中加入DPP-4抑制剂Diprotin A后，体系的荧光强度 降低。
[0063] 这是因为，荧光探针TPE-KFPE本身基本无荧光吸收，但当DPP-4加入后，DPP-4切 断荧光探针中多肽N端两个氨基酸，使得四苯乙烯骨架产生了荧光吸收。在Diprotin A存 在下，DPP-4的活性受到抑制，无法水解多肽，从而四苯乙烯骨架的荧光吸收降低，体系的荧 光强度也降低（如图4)。
[0064] 实施例3荧光探针TPE-KFPE在筛选DPP-4抑制剂中的应用
[0065] (1)荧光探针TPE-KFPE在筛选DPP-4抑制剂中的应用
[0066] 取1 μ L荧光探针TPE-KFPE (ImM)，加入5 μ L DPP-4 (lOOmU/mL)和一定体积不同浓 度 Diprotin A 母液（使得 Diprotin A 终浓度为 0.005,0.025,0.05,0· 1，0.2,0.5, 5,10， 20, 50,100 μ M)，以缓冲液 HEPES pH 7. 0 补齐至 100 μ L，37°C孵育 30min 后用 Tecan 酶标仪 测量，设定 ExS 320nm (± 25nm)，E "为 450nm (± 25nm)。
[0067] 检测结果见图5。
[0068] 由图5可见，随着Diprotin A浓度的提高，Diprotin A对DPP-4的抑制效应也逐 渐增加；表明荧光探针TPE-KFPE能较好地反映抑制剂对DPP-4的抑制作用，可用于DPP-4 抑制剂的筛选。
[0069] (2)荧光探针TPE-KFPE在基于细胞荧光图像的DPP-4抑制剂筛选中的应用
[0070] 取终浓度为50 μ M的荧光探针TPE-KFPE，加入离体培养的3T3-L1前脂肪细胞，孵 育1小时后，洗去培养液，采用Nikon AlR显微镜，DAPI通道拍摄细胞荧光图像，结果如图 6A和图6B所示。
[0071] 已知Diprotin A为DPP-4的抑制剂，从图6A和图6B中可以看出，在细胞层面上， 荧光探针TPE-KFPE能够较好地反映 DPP-4的抑制。
[0072] 实施例4荧光探针TPE-KFPE对DPP-4的检测灵敏度考察
[0073] 取20 yL荧光探针TPE-KFPE(50 μΜ)，不同浓度DPP-4(终浓度分别为0. 1，0. 2， 0· 3,1，5, 20mU/mL)，以缓冲液 HEPES pH 7. 0 补齐至 100 μ L，37°C孵育 30min 后用 Tecan 酶 标仪测量，设定 320nm(±25nm)，E "为 450nm(±25nm)。
[0074] 检测结果见图7。
[0075] 由图7可见，荧光探针TPE-KFPE对DPP-4的线性检测范围为0. 1-0. 4mU/mL，检测 限为 〇. ImU/mL。
[0076] 实施例5荧光探针TPE-KFPE对DPP-4的检测特异性考察
[0077] 在1 μ L荧光探针TPE-KFPE (ImM)中，加入终浓度均为5mU/mL的DPP-4、人血清白 蛋白、牛血清白蛋白、胶原酶I、胶原酶II、细胞色素 C和溶菌酶，以缓冲液HEPES pH 7.0 补齐至100yL，37°C孵育30min后用Tecan酶标仪测量，设定Ex为320nm(±25nm)，Em为 450nm(±25nm) 〇
[0078] 检测结果见图8。
[0079] 由图8可见，除DPP-4组的信号较强外，其他对照组的信号均较弱，表明荧光探针 TPE-KFPE仅能被DPP-4特异性识别并经DPP-4切断N端二肽后产生荧光吸收，荧光探针 TPE-KFPE对DPP-4具有较强的检测特异性。
[0080] 实施例6荧光探针TPE-KFPE的细胞毒性测试
[0081] 取终浓度为10,30和50 μΜ的TPE-KFPE，加入到离体培养3T3-L1前脂肪细胞中， 孵育24小时后，用MTT法检测细胞活性。
[0082] 检测结果见图9。
[0083] 由图9可见，当荧光探针TPE-KFPE浓度小于50 μ M时，24小时内对细胞无毒性。
【主权项】
1. 一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：EPFK。2. -种具有聚集诱导发光特性的荧光探针，其特征在于，由权利要求1所述的多肽与 聚集诱导发光分子连接而成，所述聚集诱导发光分子与所述多肽中的赖氨酸相连。3. 如权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，所述聚集诱导发光分子包含由至少一 个四苯乙烯分子构成的基本骨架。4. 如权利要求3所述的荧光探针，其特征在于，其结构式如式（I )所示：5. 如权利要求4所述荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 通过固相多肽合成反应合成权利要求1所述的多肽； (2) 以4-羟基二苯酮和二苯酮为原料制备化合物A :(3) 在碳酸盐存在下，利用卤代乙酸乙酯与化合物A进行取代反应，获得化合物B :(4) 对化合物B进行还原，获得化合物C :(5) 利用步骤⑴所述的多肽与化合物C进行固相多肽合成反应，获得如式（I )的荧 光探针。6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（4)中，利用强碱对化合物B进行 还原。7. 如权利要求2~4任一所述荧光探针在DPP-4活性检测中的应用。8. 如权利要求2~4任一所述荧光探针在DPP-4抑制剂筛选中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于DPP-4检测的多肽及包含该多肽的荧光探针。该荧光探针由特异性识别DPP-4的多肽与聚集诱导发光分子连接而成，多肽的氨基酸序列为：谷氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸，聚集诱导发光分子与多肽中的赖氨酸相连。由于多肽N端第二位含有脯氨酸，使得该荧光探针中的多肽能被DPP-4特异性识别，切断该多肽；该荧光探针本身基本无荧光吸收，但当其失去N端二肽时，则会产生明显的荧光吸收，从而能对DPP-4活性进行特异性的实时检测。
【IPC分类】C09K11/06, G01N21/64, C07K5/113
【公开号】CN105061557
【申请号】CN201510507259
【发明人】程翼宇, 王毅, 赵筱萍
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月18日