基因拟南芥比WT拟南芥抗逆能力强。
[0135] 3. 3. 3. 3苯胺蓝染色法分析逆境下转基因植株细胞的受损情况
[0136] 苯胺蓝染色法原理是正常的细胞具有完整的功能正常的细胞膜，使外界的苯胺蓝 无法进入细胞内部，如果功能不正常或者膜不完整的细胞，导致被苯胺蓝染成蓝色。分别用 取在培养基中培养6d的组培苗，放入含0. 5mol/l、lmol/L和1. 5mol/L的化S〇4培养基中 培养1化后在苯胺蓝中染色1化如图24。结果表明：在正常生长条件下，所有株系根部上 的蓝色比较淡且无明显差异，说明细胞损伤的情况基本相同；在化胁迫条件下，随着胁迫 时间的增加转基因株系植株W及WT植株根部的颜色均明显变深。过表达株系根部的颜色 明显比WT植株叶片的颜色浅，说明转基因植株根部的损伤程度较WT损伤程度小。试验结 果说明P地SFA4a基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗高化作用。
[0137] 3. 3. 4化胁迫下转基因拟南芥各项生理指标的研究
[013引将转基因拟南芥（line2、line4和line5)和野生型拟南芥（WT)Ts代纯合系的 种子消毒后，播种于1/2MS培养基上，待种子萌发7d后，移入±中继续生长3周后。之后用 ZnS04溶液诱灌处理4化后，取不同植株的叶片用于W下生理生化指标的测定分析，用正常 生长条件下植株的叶片作为对比。
[0139] 3. 3. 4. 1MDA(丙二醒）含量的测定
[0140] 植物在逆境条件下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，可通 过检测MDA的含量来检测膜脂过氧化的程度，W间接测定膜系统受损程度和植物的抗逆 性，结果如图25所示：结果如下：在胁迫条件下，转基因株系和WT的MDA值都有提高，在化 胁迫条件下，转基因株系及WT的MDA的含量改变的程度不同。采用单因素方差分析先进行 组内比较，发现当a= 0. 05，P<0. 01，在化胁迫条件下转基因株系的MDA值相对WT的MDA 值差异极显著。很好的说明了转基因株系中MDA活性的升高没有WT的MDA活性升高的程 度大，过表达株系的MDA含量明显低于WT，说明了转基因植株的抗高化胁迫能力明显优于 WT，试验结果表明P地SFA4a基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗高化功能。
[0141] 3. 3. 4. 2SOD(超氧化物歧化酶）活性的测定
[0142] SOD能够通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（妒-)，生成&〇2和0 2,抵御 活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的损伤，增强了植物的抗逆功能，如图26,结果 如下：WT和转基因株系在在各种胁迫下SOD活性都比正常情况下有所增加，说明了在胁迫 下WT和转基因株系都增加了清除超氧自由基（妒-)的能力，对各种条件进行组内单因素分 析，在正常生长条件下（control)，当a= 0. 05,0. 01<P<0. 05,WT与转基因株系差异显著， 说明在正常情况下转基因株系比WT的SOD活性高一些；在化胁迫条件下，当a= 0. 05， P<0. 01，WT与转基因株系差异极显著，说明了在化胁迫下转基因株SOD活性比WT的SOD 活性高很多。P地SFA4a基因的过表达株系的抗逆境胁迫能力明显优于WT试验结果表明： P地SFA4a基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗高化功能。
[0143] 3. 3. 4. 3POD(过氧化物酶）活性的测定
[0144] POD是生物体内酶促防御系统的重要保护酶，能够清除植物体内氧自由基，提高其 抗逆性。结果如图27所示：结果如下：WT和转基因株系在胁迫下POD活性都比正常情况下 有所增加，说明了在胁迫下WT和转基因株系都增加了清除体内氧自由基的能力，采用单因 素方差分析进行组内比较，发现在正常生长条件下（control)，a= 0. 05,P〉0. 05,差异不 显著，转基因株系W及WT的POD活性基本相同；在化胁迫条件下，a= 0. 05,P<0. 01，差异 极显著，转基因株系W及WT的POD活性都发生显著的改变。P地SFA4a基因的过表达株系 POD活性都高于WT，说明转基因植株的抗高化胁迫能力明显优于WT株系。试验结果表明 P地SFA4a基因在拟南芥植株体内起着非常重要的抗高化功能。
[0145] 3. 3. 4. 4 &〇2含量的测定
[0146] &〇2是体内活性氧代谢的产物。H202的产生可W直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋 白质等生物大分子，从而使细胞膜遭受损害，加速了细胞的衰老和解体，&化的含量越高代 表细胞的受损伤程度越大，结果如图28所示：
[0147] 结果如下：WT和转基因株系相对于正常生长情况在各种胁迫下&〇2含量都有所升 高，在正常生长条件下（control)，利用单因素分析，当a= 0. 05时，P〉0. 05,说明了WT与 =个不同转基因株系的&〇2含量差别不显著；在化SO4生物胁迫条件下，当a= 0. 05时， P<0. 01，WT与各个转基因株系的电〇2含量差别极显著，说明了在化胁迫条件下P地SFA4a 基因的过表达株系Line2、line4和line5中&〇2含量明显低于WT，说明line2、line 4和line5的抗高化胁迫能力明显高于WT。试验结果说明P地SFA4a基因在拟南芥植株 体内起着非常重要的抗高化作用。
[014引 3. 3.4. 5相对电导率含量的测定
[0149] 相对电导率是衡量细胞膜透性情况的一个生理指标，细胞膜在逆境胁迫下受损最 后导致了细胞内的电解质外渗，相对电导率越大表明细胞膜的破坏程度越大最后影响植物 的抗逆能力。结果如图29所示：
[0150] 结果如下：WT和转基因株系相对于正常生长情况在各种胁迫下相对电导率都有 所升高，在正常生长条件（control)、ZnS〇4非生物胁迫条件下，进行组内单因素分析，当a = 0.05时，P<0. 01，说明了WT和line 2、line 4和line 5 S个不同转基因株系的相对电 导率差异极显著。P地SFA4a基因的过表达株系比WT的相对电导率小很多，说明运S个株系 抗逆程度基本相同且远强于WT株系。试验结果说明P地SFA4a基因在拟南芥植株体内起着 非常重要的抗高化作用。
[0151] 实施列1~3中所用药品皆为市售产品。从实施例可知，利用农杆菌介导法将包 括P地SFA4a基因的地I121-GFP的质粒转入野生型拟南芥植株。获得转基因株系，选取过 表达植株中基因表达量比较高的=个株系line2、line4和line5和野生型拟南芥株系 WT用于各种非生物胁迫下萌发率的观察，最后发现在高化胁迫下转基因株系的萌发率高。 于是我们更进一步的验证实验结果，通过对不同生长阶段的Ts代纯合植系和WT进行高化 条件下的抗逆能力分析。在根长实验中，转基因株系的根长比WT长而且侧根也比较多。对 成苗在胁迫条件下的长势研究表明，在胁迫后恢复生长发现转基因株系的长势明显强于WT 植株。再一次说明P地SFA4a基因在高化胁迫下具有很重要的抗逆功能。同时通过DAB染 色、NBT染色、苯胺蓝染色对转基因株系和WT在高化胁迫下细胞的受损情况进行了观察， 发现在高化胁迫下WT细胞受损程度明显高于转基因株系，也验证了上面的结论。通过各 项生理指标的测定，发现在高化胁迫条件下，P地SFA4a基因的过表达株系的抗逆能力明显 高于WT，其中line2的抗逆能力最高。本实验说明P地SFA4a基因转入拟南芥植株体内提 高了植物在高化胁迫下的抗逆能力。
【主权项】
1. 毛果杨PtHSFA4a基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所 不。2. 编码权利要求1所述的毛果杨PtHSFA4a基因的氨基酸序列，其特征在于该基因的氨 基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示。3. 如权利要求1所述的毛果杨PtHSFA4a基因的应用，其特征在于它在提高植物在高 Zn胁迫下抗逆能力上的应用。
【专利摘要】毛果杨PtHSFA4a基因及其氨基酸序列和应用，它涉及一种毛果杨PtHSFA4a基因及其氨基酸序列和应用。其目的是提供毛果杨PtHSFA4a基因及其氨基酸序列和应用。毛果杨PtHSFAa基因的核苷酸序列如序列表中SEQ？ID？NO：1所示；氨基酸序列如序列表中SEQ？ID？NO：2所示。该基因可以提高植物在高Zn胁迫下抗逆能力上的应用。本发明利用农杆菌介导法在拟南芥中过表达该基因，获得的拟南芥转基因株系有效地提高了植物对高Zn胁迫下的耐受性的特征。通过本发明可培育出抗高Zn的转PtHSFA4a基因的新品种，对林木分子育种的新品种培育方面具有重要的理论及实际意义。本发明应用于林木分子育种领域。
【IPC分类】C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00, C07K14/415
【公开号】CN105219785
【申请号】CN201510785641
【发明人】杨传平, 张海珍, 李成浩, 杨静莉
【申请人】东北林业大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月16日