水牛特异性引物、试剂盒及其在水牛源性成分鉴定中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及动物分子生物学领域，具体设及水牛特异性引物、试剂盒及其在水牛 源性成分鉴定中的应用。
【背景技术】
[0002] 随着人民生活水平的提高，肉品消费量的增加，市场上也出现了各种肉制品渗假 的现象。在肉品的进出口贸易中，由于我国对肉品质质量的检验方法较为落后，错检、漏检 现象时有发生。W次充好，渗杂渗假严重影响了公平交易、食品安全，甚至设及到宗教信仰 问题。因此肉制品来源的安全性成为消费者关屯、的焦点问题之一，而对肉制品的来源进行 鉴定并建立便捷的检测方法是解决运一问题的关键。
[0003] 现有技术中对于肉源食品的鉴定主要包括蛋白质分析法，例如电泳法、免疫法等 技术，运对于生肉的鉴别具有一定可行性，但特异性差、准确率低。国内已发表的针对水牛 属特异性的检测方法，是通过大量的测序工作和比对分析，获得属间物种特异性基因位点， 由此设计特异性引物并用于物种鉴别。然而针对该目标序列设计的特异性引物仅可用于水 牛、黄牛与巧牛的鉴别，而对其他物种是否也适用并未做研究。因此，如何有效、准确地判别 出肉制品是否属于水牛肉，并建立一种简单易行的检测方法具有紧迫性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种可用于水牛源性制品特异性检测 的引物；
[0005] 本发明的第二个目的在于提供用于水牛源性制品检测的检测试剂盒；
[0006] 本发明的目的还在于提供水牛源性成分的鉴定方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行 水牛基因组特异DNA序列的筛选，经过普通牛、羊（绵羊、山羊）、猪、马、驴、鼠（大鼠、小鼠、 仓鼠）、豚鼠、鸡、鸭、碟、兔、狗、狐、水貂和骆子的基因组DNA及不同的水牛品种DNA中的检 ，筛选在水牛中特异的、在其他物种中不存在或同源性低的DNA片段作为检测分子。经过 大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用的特异DNA序列，其核巧酸序列如序列表SEQ IDNo. 1 所示。
[0008] 基于此，本发明首先提供一种水牛特异性引物，其能特异性扩增SEQIDNo. 1所示 的核巧酸序列或该序列的特异性片段。
[0009] 优选地，引物长度为18~27bp。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片 段长度、反应溫度等多方面。
[0010] 优选地，该引物序列如下：
[0011] SUBALUS-F: 5, -GAAGAAGAGGGAGGGGTAGACAA-3,
[0012] BUBALUS-R:5' -CAGAACTAGTGAAGGCGGCA-3';
[0013] 或该引物向5'、3'端延伸或修饰得到的仍能特异性扩增SEQIDNo.I所示序列 的引物。
[0014] 进一步，本发明提供含有上述特异性引物的检测试剂盒。
[001引优选地，所述试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgClz、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂中的一种或多种：TaqDNA MasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。
[0016] 所述阳性对照DNA模板为牛科水牛属的水牛基因组DNA模板；
[0017] 进一步，本发明提供上述的水牛特异性引物或检测试剂盒在水牛源性成分鉴定中 的应用。
[0018] 本发明还提供水牛特异性引物、试剂盒及其在水牛源性成分鉴定中的PCR检测方 法，其步骤如下所述：
[0019] 1)提取样品基因组DNA;
[0020] 2)用上述的引物进行PCR扩增，并W水牛DNA模板为阳性对照，W双蒸水为空白对 照；
[0021] 3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。
[002引优选地，其中步骤2)PCR扩增的反应体系如表1 [0023]表1本发明PCR扩增的反应体系
[002引PCR反应程序如下：
[0026] 94°C预变性 5min;94°C变性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 133,30次循环；4°(：降溫 2min〇
[0027] 结果判定方法是：当PCR反应产物与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增 产物时，判定样品中检测出水牛源性成分；当PCR反应产物无扩增产物或与阳性对照扩增 产物不符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中未检测出水牛源性成分；如果阳性样品未 检测出预期片段，说明试剂失效或操作失误；若空白对照与阳性样品均检出，说明试剂污染 或操作失误。
[0028] 本发明中检测结果可用琼脂糖凝胶电泳呈现，也可用测序或其他有效方法检测； 提取样品DNA的方法可用苯酪-氯仿提取法，也可使用公认的、具有相同效力的其他提取方 法。
[0029] 本发明提供了有效的、精准的、可靠的水牛源性成分分子鉴定方法，所组装的试剂 盒能快速鉴定样品中是否含有水牛源性成分。本发明的方法可W在肉品、饲料和皮张检测 中作为标准检测方法使用。本发明试剂盒及检测方法具有简便、快速、全面、特异性强的特 点，且成本较低，适用性广。
【附图说明】
[0030] 图1是SEQIDNO. 1核巧酸特异序列在水牛中具有物种特异性的检测结果。W牛 科水牛属的水牛、牛科非水牛属动物（普通牛、绵羊、山羊）和非牛科哺乳动物（小鼠、大 鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、兔、狐、狗、水貂、骆子）W及非哺乳动物（鸡、鸭、碟）的基因组 DNA为模板，扩增SEQIDNo. 1所示的特异片段，所有测试样品中仅在水牛中得到扩增产物， 非水牛物种中均无扩增产物。结果表明所扩增片段在水牛中具有特异性。泳道中编号说明 如下：M:为DL2000P1USDNAMarker;1-3 :空白对照；4-6 :水牛；7-9 :小鼠；10-12 :大鼠； 13-15 :仓鼠；16-18 :豚鼠；19-21 :普通牛；22-24 :绵羊；25-27 :山羊；28-30 :猪；31-33 : 马；34-36 :驴；37-39 :鸡；40-42 :鸭；43-45 :碟；46-48 :兔；49-51 :狐；52-54 :狗；55-57 : 水貂；58-60 :骆子。
[0031] 图2:是SEQIDNO. 1核巧酸特异序列在水牛不同DNA模板浓度中的灵敏度检测结 果。分别Wo.Ing/yLlng/yUlOng/yLIOOng/yL的水牛DNA为模板，扩增沈QIDNO. 1 核巧酸特异片段，Ing/yL的模板浓度即有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵 敏性。泳道中编号说明如下：M:为DL2000P1USDNAMarker;l-4:空白对照；5-8:0.Ing/ yL的模板浓度；9-12 :Ing/yL的模板浓度；13-16 :IOng/yL的模板浓度；17-20 :IOOng/ yL的模板浓度。
【具体实施方式】
[0032]W下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本 发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修改或润色均属于本发明的范围。
[0033] 实施例1样品中水牛源性成分特异性检测
[0034] 1.试样的制备与保存
[0035] 1. 1 取样
[0036] 采集水牛肉样品Ig,于-20°C下保存备用。
[0037] 1.2DNA模板制备
[0038]DNA模板制备采用常用的苯酪-氯仿粗提法（萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂 斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁，黎孟枫.北京：科学出版社，1999. 465-467) 或者公认的、具有相同效力的其他提取方法，运些方法都是报道的常用方法。
[0039] 2.引物设计
[0040] 本实施例的引物序列如表2和序列表SEQIDNO:2和3所示。
[00川表2本发明设计的PCR扩增引物
[0043]
[0044] 预期扩增片段大小为23化p，其核巧酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。
[0045] 实验表明，该引物特异性强，在水牛各品种中均能有效扩增，而在其他18个非水 牛物种中都无目的片段扩增；且引物的灵敏度较高，在模板DNA浓度为Ing/uL时即可扩增。 W上述引物分别向3'、5'延伸一个碱基和两个碱基或修饰形成的引物对进行实验，实验 表明仍能进行特异性扩增，