从经济型和综合效果来看W表2中的引物最佳。
[0046] 3.PCR检测
[0047] 3. 1试样PCR反应
[0048]3. 1. 1在PCR反应管中依次加入反应试剂（见表1)，混匀，再加25yL石蜡油（有 热盖设备的PCR仪可不加）。
[0049] 3. 1. 2将PCR管在离屯、机上500g~3000g离屯、10s，然后取出PCR管，放入PCR仪 中。
[0050] 3. 1. 3 进行PCR反应。程序为：94°C预变性 5min;94°C变性 30s，60°C退火 30s，72°C 延伸13s，共进行30次循环；4°C降溫2min。
[0051] 3. 1. 4反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。
[0052] 3. 2对照PCR反应
[0053] 3. 2. 1在试样PCR反应的同时，设置空白对照、阴性对照及阳性对照。各对照PCR 反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与3. 1相同，且阴性、阳性对照DNA模板浓 度也应达到试样DNA模板浓度要求。
[0054] 3.2.2W牛科非水牛属动物（普通牛、绵羊、山羊）和非牛科哺乳动物（小鼠、大 鼠、仓鼠、豚鼠、猪、马、驴、兔、狐、狗、水貂、骆子）W及非哺乳动物（鸡、鸭、碟）的基因组 DNA作为PCR反应体系的阴性对照模板。
[005引 3. 2. 3W牛科水牛属的水牛基因组DNA作为PCR反应体系的阳性对照模板。
[0056] 3. 2. 4W双蒸水作为PCR反应体系的空白对照模板。
[0057] 4.PCR扩增产物的检测及结果判定
[0058] 按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1XTAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖 溶液。每IOOmL琼脂糖溶液中加入5yL邸溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上， 插上梳板，室溫下凝固成凝胶后，置于1XTAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取5yL PCR产物与1yL加样缓冲液（称取250.Omg漠酪蓝，加入IOmL水，在室溫下溶解12h;称取 250.Omg二甲苯腊蓝FF，加10血水溶解；称取50.Og薦糖，加30血水溶解。混合W上S种 溶液，加水定容至IOOmU在4°C下保存）混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中 加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm~5V/cm条件下电泳15~30min后检测。
[0059] 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA 分子量标准判断扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。
[0060] 5结果分析与表述
[0061] 5.1对照检测结果分析
[006引如图I所示，阳性对照的PCR反应中，水牛SEQIDNo.I所示的特异性序列得到扩 增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照及空白对照中除引物二聚体外没有 任何扩增片段，表明PCR反应体系工作正常。
[0063] 5. 2样品检测结果分析和表述
[0064] 5. 2.1若水牛SEQIDNo.1所示的特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片 段大小一致，表明样品中检测出水牛所述的特异性序列，表述为"样品中检测出水牛源性成 分"。
[0065] 5. 2. 2若水牛SEQIDNo.1所示的特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期 片段大小不一致，表明样品中未检测出水牛所述的特异性序列，表述为"样品中未检测出水 牛源性成分"。
[0066] 实施例2灵敏度试验
[0067]分别W0.Ing/yL、Ing/yL、IOng/yL、IOOng/yL的水牛DNA为模板，按照实施例 1的条件，扩增SEQIDNO. 1核巧酸特异片段。结果如图2所示，Ing/iiL的模板浓度即有 扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。
[006引实施例3试剂盒的组装
[0069] 该试剂盒的组成包括：
[0070]上游引物（SEQIDNo. 2);
[007U 下游引物（SEQIDNo. 3);
[0072] 2XhqDNAMasterMix ;
[0073] 阳性对照DNA模板（水牛DNA模板）；
[0074] 双蒸水。
[00巧]本试剂盒-20°C储存12个月不影响使用效果。
[0076] 试剂盒的应用方法：
[0077] 1.依据W下的PCR反应体系加样，于200yL的EP管：
[0079] 2 X化q DNA MasterMix(购自北京艾德莱生物科技有限公司）是将PCR反应所需 的Taq酶、dNTP混合物、MgClzW及反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物。
[0080] 2.依据实施例1的PCR扩增条件上样
[0081] 3.反应结束后取SiiLPCR扩增产物，2.0%的琼脂糖凝胶电泳（技术参数：2V/ cm~5V/cm，电泳15min~30min)，用漠化乙锭染色，凝胶成像系统检测结果。
[0082] 每个反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。
[008引序列表说明：
[0084] SEQIDNO. 1是目标核巧酸片段的核巧酸序列，序列长度为23化P;
[0085] SEQIDNO. 2是扩增上述核巧酸片段的正向引物序列；
[0086] SEQIDNO. 3是扩增上述核巧酸片段的反向引物序列。
【主权项】
1. 水牛特异性引物，其特异性扩增SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列或该序列的特异性 片段。2. 根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的单条引物长度 为 18 ~27bp。3. 根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，该引物序列如下： BUBALUS-F: 5, -GAAGAAGAGGGAGGGGTAGACAA-3, BUBALUS-R：5, -CAGAACTAGTGAAGGCGGCA-3r ； 或该引物向5'、3'端延伸或修饰得到的仍能特异性扩增SEQIDNo. 1所示序列的引 物。4. 含有权利要求1~3任一项所述特异性引物的检测试剂盒。5. 根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，其还包括下述试剂中的一种或多 种：Taq酶、dNTPs、MgCl2、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂中 的一种或多种：Taq DNA MasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。6. 根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照DNA模板为牛科水牛 属的水牛基因组DNA模板，空白对照为双蒸水。7. 根据权利要求1~3任一项所述的水牛特异性引物或权利要求4~6任一项所述的 检测试剂盒在水牛源性成分鉴定中的应用。8. 水牛源性成分的PCR检测方法，其步骤如下所述： 1) 提取样品基因组DNA; 2) 用权利要求1~3任一项所述的引物进行PCR扩增，并以水牛DNA模板为阳性对照， 以双蒸水为空白对照； 3) 对PCR扩增产物进行检测和结果判定。9. 根据权利要求8所述的PCR检测方法，其中步骤2)PCR扩增的反应体系如下：PCR反应程序如下： 94°(：预变性51^11;94°(：变性3〇8,60°(：退火3〇8,72°(：延伸138,30次循环 ；4°(：降温 2min〇
【专利摘要】本发明提供了一种水牛特异性引物、试剂盒及其在水牛源性成分鉴定中的应用，属于动物种源性成分分子检测技术领域。本发明中，水牛特异性引物是能特异扩增SEQ？ID？No.1所示的核苷酸序列或该序列的特异性片段的引物对SEQ？ID？No.2&3。本发明试剂盒包括所述水牛特异性引物、反应试剂以及阳性和空白对照。采用本发明的引物扩增样品DNA，对PCR扩增产物进行分析，可判定样品中是否含有水牛源性成分。本发明为肉制品、皮张和饲料中水牛源性成分的检测提供了有效、精准、可靠的手段，具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105296476
【申请号】CN201510814871
【发明人】刘榜, 王文君, 刘建建, 张庆德
【申请人】华中农业大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月20日