采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子细胞的方法及制备该细胞用的基材及该细胞的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医疗器械改性领域以及纳米材料领域，具体涉及一种在细胞培养基材(包括细胞培养板和其他可用于细胞培养的基材)表面修饰金纳米材料(包括金纳米粒子聚集体、金纳米棒、金纳米锥等)的试剂盒，利用近红外波段激光辅助，实现对其上培养细胞进行外源大分子传输的目的。该试剂盒具有简单直接、快速、高效的特点，并且可应用于不同细胞系进行外源大分子的传输。
【背景技术】
[0002]基因治疗和药物传输可以应用于对许多重大疾病的治疗中，包括癌症、神经退行性疾病、血液疾病和遗传疾病等。基因治疗和药物传输的关键在于能否有效地将外源治疗性分子(比如DNA、RNA、蛋白质、药物分子等)导入到目的细胞中。病毒载体虽然具有很高的传递效率，但安全性制约了其进一步的应用。目前，通常采用的手段是用阳离子脂质体或聚合物包裹治疗性大分子，通过胞吞将其传递到细胞中。然而，这种方法传递效率低，同时面临细胞毒性的问题，并且负载的大分子进入细胞后不能完全被载体释放进一步降低了其最终效率。
[0003]光致穿孔近年来受到广泛关注，其最简单的形式是用高强度的飞秒级激光脉冲照射单个细胞以提高细胞膜的通透性，但这种形式的效率很低。然而研究者发现，通过在细胞膜上吸附金纳米粒子不仅可以大大提高效率，并且可以减低所需的激光强度。这主要是因为吸附在细胞膜上的金纳米粒子在激光照射下可以产生很大的能量，这种能量可以用来提高细胞膜的通透性。此外，金纳米粒子具有优异的生物相容性和化学反应活性，这都为金纳米粒子在光致穿孔中的广泛应用奠定了基础。
[0004]在此专利中，我们研发了一种新型的基于金纳米材料的光致穿孔试剂盒，该试剂盒能够利用激光能量提高细胞膜通透性以实现外源分子的高效细胞传输。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种新型的基于金纳米材料的光致穿孔体系，该体系可以实现外源大分子简单直接、快速、高效的细胞运输。
[0006]为达到上述目的，本发明采用的第一种技术方案为:一种采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子的细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤:
1)采用纳米金结构修饰细胞培养基材；
2)在修饰过的细胞培养基材中培养细胞；
3)用近红外波段的激光光源照射细胞适当时间；
4)向细胞中添加需要传递的外源分子，然后培养一段时间。
[0007]本发明一个较佳实施例中，在步骤1)中，在细胞培养基材上修饰的所述纳米金结构是采用向所述细胞培养基材中加入镀金液静置的方法实现的。
[0008]本发明一个较佳实施例中，所述镀金液为先配制成的含有弱碱溶质、还原剂，氯金酸的溶液，然后用碱溶液将所述溶液pH值调节至弱碱性，即得所述镀金液。
[0009]本发明一个较佳实施例中，在步骤1)中，所述镀金液的配制是在0_10°C条件下进行的，所述镀金液在所述细胞培养基材内的静置是在20-60°C条件下进行的。
[0010]本发明一个较佳实施例中，所述弱碱溶质为碳酸氢钾，所述还原剂为葡萄糖。
[0011]本发明一个较佳实施例中，所述镀金液中的碳酸氢钾、葡萄糖、氯金酸的浓度依次为:0.1-1 M，10-30 mM，5-20 mM。
[0012]本发明一个较佳实施例中，步骤2)中的细胞培养基材为培养板，在48孔培养板中，每个所述培养孔内的种植细胞的密度为4-5X 104/培养孔。
[0013]本发明一个较佳实施例中，在步骤2)和步骤4)中，细胞培养均采用向所述培养孔中注入含血清的细胞培养基的方式进行。
[0014]本发明一个较佳实施例中，在步骤2 )进行前还需要对细胞培养基材进行清洗和消毒。
[0015]本发明一个较佳实施例中，在步骤3 )中，清洗细胞采用无菌PBS溶液。
[0016]本发明一个较佳实施例中，步骤4)中添加的外源分子是混合在无血清的细胞培养基试剂内后添加的。
[0017]本发明一个较佳实施例中，步骤3)和步骤4)中的激光照射与添加外源分子的顺序可以是:
先进行激光照射，再进行添加外源分子；或先进行添加外源分子，再进行激光照射。
[0018]本发明一个较佳实施例中，还包括使用胰蛋白酶溶液消化收获载有外源分子的细胞的步骤。
[0019]本发明采用的第二种技术方案为:一种用于制备纳米金结构的镀金液，其特征在于:所述镀金液是由将弱碱溶质、还原剂，氯金酸三种溶质配制成的。
[0020]本发明一个较佳实施例中，所述弱碱溶质为碳酸氢钾，所述还原剂为葡萄糖，所述镀金液中的碳酸氢钾、葡萄糖、氯金酸的浓度依次为:0.1-1 M，10-30 mM，5-20 mM。
[0021]本发明一个较佳实施例中，所述镀金液稳定的溶液状态条件为保持0_10°C的温度，所述镀金液容易形成金纳米粒子聚集体的条件为保持20-60°C的温度。
[0022]本发明采用的第三种技术方案为:一种使用金纳米粒子聚集体修饰的细胞培养基材:所述基材为带有若干个培养孔的培养板，其特征在于，所述培养板的培养孔内表面沉降有一层稳定的金纳米粒子聚集体。
[0023]本发明一个较佳实施例中，所述金纳米粒子聚集体是由存放在所述培养孔内的镀金液在20-60°C的条件下自然沉降形成的。
[0024]本发明采用的第四种技术方案为:一种载有外源分子的细胞，其特征在于，所述细胞包括:细胞本体和进入细胞本体内部的外源分子，所述细胞可以是外源分子直接透过细胞膜进入到细胞本体内形成的细胞，也可以是通过内部存在有外源分子细胞的裂变产生的细胞。
[0025]本发明一个较佳实施例中，所述外源分子可以是糖分子或/和蛋白质或/和RNA或/和DNAo
[0026]本发明采用的第五种技术方案为:一种载有外源分子细胞的细胞检测筛选方法，其特征在于，包括以下步骤:
a)在第一种技术方案的步骤4)中，将标记试剂与所述外源分子充分混合后再向细胞添加，然后继续培养一段时间，即得载有外源分子的细胞；
b)通过倒置荧光显微镜观察标记试剂进入细胞的情况。
[0027]本发明一个较佳实施例中，所述标记试剂为荧光素四甲基异硫氰酸罗丹明标记的右旋糖酐分子，可以简称为罗丹明-右旋糖酐。
[0028]一种采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子的细胞的方法，包括以下步骤:
(1)在o-1o°c条件下，配制含有碳酸氢钾、葡萄糖，氯金酸的水溶液，然后用碱溶液将溶液pH调节至弱碱性；最终所得溶液中，碳酸氢钾、葡萄糖、氯金酸的终浓度依次为:0.1-1M，10-30 mM, 5-20 mM ;以每孔300 μ L的量，将所得溶液加入到48孔细胞培养板的孔中，然后于20-60°C下静置3-6 h，弃去孔中溶液，再用去离子水冲洗至少2次后，即制得稳定的金纳米粒子聚集体修饰的多孔板。
[0029](2)通过试剂1 (主要成分为乙醇)浸泡对细胞培养板进行消毒，之后将目的细胞以4-5X 104个/孔的密度种植到48孔板的孔中，利用试剂2 (主要成分为含血清的细胞培养基)培养6-12 h使细胞在板中充分铺展。
[0030](3)用试剂3 (主要成分为无菌PBS)清洗细胞，加入试剂4 (主要成分为无血清培养基)。用近红外波段的激光光源在1-10 W/cm2功率密度范围内对孔中细胞照射0.5-10min0
[0031](4)激光照射完毕后，在培养基中迅速加入试剂4 (主要成分为含一定浓度的待传递外源分子的无血清培养基)，继续培养20 min，加入试剂5 (主要成分为血清)和试剂4至
1mL体积，继续培养细胞24-48 h。(当然此步骤中，也可以是先在培养基中加入试剂4，然后在进行激光照射)
(5)利用试剂6 (主要成分为0.25%的胰蛋白酶溶液)消化收获细胞。
[0032]上述技术方案中，碳酸氢钾、葡萄糖，氯金酸粉末均为分析纯，所用溶剂水为去离子水。所述碱溶液为本领域技术人员公知的中强碱，不与反应体系中物质发生反应且能将最终溶液的pH值调节到弱碱性即可，如氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钠。
[0033]上述技术方案中，激光的功率密度和照射时间可根据不用细胞系和待传递分子进行优化筛选。
[0034]上述技术方案中，细胞经激光照射、外源大分子添加、血清补加后的继续培养时间根据不同外源分子发挥功能所需的时间而定。
[0035]本发明的原理是:采用化学还原的方法生成金纳米粒子并通过物理沉降作用吸附在多孔板表面形成稳定、形貌均一的金纳米粒子聚集体，这种纳米金聚集层保留了金纳米粒子对近红外波段激光能量大量吸收的性质，吸收的激光能量可用于对提高其上培养细胞的膜通透性，实现外源分子简单直接、快速、高效的细胞运输；并且阻止了游离金纳米粒子进入细胞可能引发的潜在危害。
[0036]由于上述技术方案的应用，与现有技术相比，本发明具有以下突出特点:
1.外源大分子不进行阳离子脂质体或聚合物包裹，进入细胞后可快速发挥功能，避免了传统方法中外源分子进入细胞后不能完全被载体释放的缺点，具有简单直接的特点。
[0037]2.金纳米粒子聚集体由大量的金纳米粒子组成，具有巨大的比表面积和独特的三维结构，可大量吸收近红外波段的激光能量，用以快速提高其上细胞膜的通透性，实