3032感受态细胞中，然后进行菌株筛选。
[0054] 制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞的方法为：a、挑取在谷氨酸棒杆菌固 体培养基上生长了 1天的谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC13032的单菌落接种到含5mL谷氨 酸棒杆菌液体培养基的大试管中，30°C培养过夜；b、取400 μ L种子液转接到30mL制备谷 氨酸棒杆菌感受态所需的液体培养基中，在30°C下150rpm的转速下振荡培养，至0D6。。达 到0· 8时（该过程需要3-5h)，在冷冻离心机中4°C下，8000rpm收集细胞；c、用10% (v/v) 的甘油洗涤细胞3-4遍，最后将细胞悬浮在0. 5mL 10%的甘油中；d、将制得的谷氨酸棒杆 菌ATCC13032感受态细胞置于-80°C超低温冰箱中保存，现用现取，使用时置于冰上融化使 用。
[0055] 电击转化法的具体过程为：a、取50yL谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞与 5 μ LpK18mobsacB_ Δ dtsRl: : dtsRl*质粒混合均匀，转入预冷的0. 2cm -次性无菌电转杯 中；b、将电转杯置于冰浴上20min ;c、冰浴后在电转参数为25yF、2. 5kV、电击时间为5ms 的条件下进行电击转化；d、电转化结束后，立即加入600 μ L的正常液体培养基；e、46°C水 浴中热击6min ;f、热击结束后将电转化后细胞在30°C条件下温育2h ;g、5000rpm离心2min 收集细胞，除去多余上清，留100 μ L上清，重悬细胞以待在筛选平板培养基上进行筛选涂 布。
[0056] 菌株筛选方法为：a、将上述重悬细胞均匀涂布在含有25 μ g/mL卡那霉素的LB固 体培养基上，30°C条件下静置培养24h，待长出菌落后挑取具有卡那霉素抗性的菌落至含有 25 μ g/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，180rpm振荡培养12h后备用；b、吸取上述含有 筛选后的菌株的液体培养基100 μ L，均匀涂布在含有100g/L蔗糖的LB固体培养基上，能 够在该固体培养基上生长的菌株细胞，即为同时具有蔗糖抗性和抗生素抗性的菌株细胞， 挑取具有双重抗性的菌株细胞的单克隆于10mL的液体培养基中，在30°C条件下180rpm振 荡培养12h后备用，采用表1中的引物对过夜菌液进行基因 PCR扩增实验；c、将扩增实验 显阳性的菌株进行液体扩大培养，以该扩大培养的菌液为模板进行PCR扩增实验；d、将步 骤c中PCR扩增产物序列送北京擎科新业生物技术有限公司进行序列测定，若测序结果与 dtsRl*基因序列相同，则证明pK18mobsacB_ Δ dtsRl: : dtsRl*质粒已导入到谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 菌株中，得到了谷氨酸突变菌株 ATCC13032-pK18mobsacB- Λ dtsRl: : dtsRl*，将 该菌株编号为A1。
[0057] 其中，步骤b和c中的PCR扩增实验的体系为：2XPrimeSTARMax Premix，25y L ; dtsRl*F，0· 5 μ L ;dtsRl*R，0· 5 μ L ;菌液，10 μ L ;ddH20,14 μ L ;总体系 50 μ L ;PCR 扩增 条件为：94°C X3min;94°C X30s;58°C X30s;72°C X45sX30 个循环；72°C X5min; 12。。X 气
[0058] 实施例2
[0059] 本实施例用于说明本发明的谷氨酸生产菌株及其制备方法
[0060] 按照实施例1的方法制备谷氨酸生产菌株，不同的是，步骤（2)中将dtsRl基因序 列的有义链的起始密码子ATG替换为偏好性低的密码子GTG，将该有义链中间第274bp到 279bp (相当于2个密码子）进行替换，使得该基因有义链转录得到的mRNA上中间位置的 2个密码子为偏好性低的密码子，从而得到经密码子偏好性改造的基因序列dtsRl# (SEQ ID No :4)，制得谷氨酸突变菌株ATCC13032-pK18mobsacB- Λ dtsRl: : dtsRl#，将该菌株编号为 A2。
[0061] 对比例1
[0062] 按照实施例1的方法制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞，然后将 pK18m〇bsaCB质粒采用实施例1的方式电击转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞，得到 已导入空质粒pK18m 〇bsaCB的谷氨酸菌株，将该菌株编号为D1。
[0063] 实施例3
[0064] 本实施例用于说明本发明的谷氨酸生产菌株及其制备方法
[0065] (1)在GenBank数据库上查找已公布的谷氨酸棒杆菌S9114菌株野生菌株的机械 应力敏感型谷氨酸外排蛋白基因 ncgll221序列（Gene ID:AFYA01000002.1)(SEQ ID No: 5)的同源序列；
[0066] (2)对上述ncgll221基因序列（SEQ ID No :5)进行密码子偏好性改造，具体步骤 为：将ncgll221基因序列的有义链的从起始密码子开始的前129bp (相当于43个密码子） 进行替换，使得该基因有义链转录得到的mRNA上的前43个密码子均为偏好性高的密码子， 从而得到经密码子偏好性改造的基因序列ncgll221*(SEQ ID N〇:6);
[0067] (3)将基因序列ncgll221*的起始密码子的上游添加该基因上游的初始同源序列 lOOObp，并在该lOOObp的初始同源序列前添加 Xba I限制性内切酶识别序列（TCTAGA)，在 该Xba I限制性内切酶识别序列前添加保护碱基（GCG);从ncgll221*的起始密码子开始的 已替换129bp (相当于43个密码子）的DNA片段的下游取lOOObp的ncgl 1221*基因序列，在 lOOObp的ncgll221*基因序列后添加 Hind III限制性内切酶识别序列（AAGCTT)，在该Hind III限制性内切酶识别序列后添加保护碱基（CGC)，获得待合成的A nCgll221::ncgll221* 基因序列（SEQ ID No : 7);
[0068] (4)对Λ ncgl 1221: : ncgl 1221*基因序列进行人工合成；
[0069] (5)对合成的 Δncgll221: :ncgll221* 基因序列进打 Xba I 和 Hind III 双酶 切，分别切除5'端6bp和3'端6bp序列，形成两端带有Xba I和Hind III酶切位点 粘性末端的线性DNA序列Ancgll221: :ncgll221*_ ;对pK18mobsacB质粒进行Xba I 和Hind III双酶切，使pK18mobsacB形成两端带有Xba I和Hind III酶切位点粘性 末端的线性DNA质粒载体pK18mobsacB-，将带有Xba I和Hind III酶切位点粘性末端 的线性DNA序列Δncgll221: :ncgll221*_与pK18mobsacB_质粒进行连接反应，得到 pK18mobsacB_Δncgll221: :ncgll221* 质粒；
[0070] 其中，对合成的Ancgll221::ncgll221*基因序列进行Xba I和Hind III双酶切 的体系为：Xba I，lyL;Hind III，lyL;10XM Buffer，2yL;Ancgll221::ncgll221*DNA， 彡1 μ g ;ddH202加至反应体系为20 μ L。反应过程为将装载上述20 μ L反应体系的EP管， 置于37°C水浴锅中进行酶切lh。
[0071] 对 pK18mobsacB 质粒进打 Xba I 和 Hind III 双酶切的体系为：Xba I，1 μ L ;Hind III，1 μ L ;10XM Buffer，2y L ;pK18mobsacB质粒，彡 1 μ g ;ddH202 加至反应体系为 20μ L。 反应过程为将装载上述20 μ L反应体系的EP管，置于37°C水浴锅中进行酶切lh。
[0072] 连接反应的体系为：Ancgll221: :ncgll221*DNA，7y L ;pK18mobsacB，1 μ L ; 10 XT4DNA Ligation Buffer，lyL;T4DNA Ligase，lyL，过程为在 16°C下连接过夜。
[0073] (6)采用电击转化法将pK18mobsacB_ Δ ncgll221: :ncgll221*质粒导入到谷氨酸 棒杆菌S9114感受态细胞中，然后进行菌株筛选。
[0074] 制备谷氨酸棒杆菌S9114感受态细胞的方法为：a、挑取在谷氨酸棒杆菌固体培养 基上生长了 1天的谷氨酸棒杆菌野生菌株S9114的单菌落接种到含6mL谷氨酸棒杆菌液体 培养基的大试管中，32°C培养过夜；b、取400 μ L种子液转接到35mL制备谷氨酸棒杆菌感受 态所需的液体培养基中，在32°C下160rpm的转速下振荡培养，至0D6。。达到0. 9时（该过程 需要3-5h)，在冷冻离心机中4°C下，8000rpm收集细胞；c、用10% (v/v)的甘油洗涤细胞 3-4遍，最后将细胞悬浮在0.5mL 10%的甘油中；d、将制得的谷氨酸棒杆菌S9114感受态细 胞置于-80°C超低温冰箱中保存，现用现取，使用时置于冰上融化使用。
[0075] 电击转化法的具体过程为：a、取60 μ L谷氨酸棒杆菌S9114感受态细胞与6 μ Lp K18mobsacB_ Δ ncgll221: :ncgll221*质粒混合均匀，转入预冷的0. 2cm -次性无菌电转杯 中；b、将电转杯置于冰浴上20min ;c、冰浴后在电转参数为25yF、2. 5kV、电击时间为5ms 的条件下进行电击转化；d、电转化结束后，立即加入800 μ L的正常液体培养基；e、46°C水 浴中热击7min ;f、热击结束后将电转化后细胞在30°C条件下温育3h ;g、5000rpm离心2min 收集细胞，除去多余上清，留200 μ L上清，重悬细胞以待在筛选平板培养基上进行筛选涂 布。
[0076] 菌株筛选方法为：a、将上述重悬细胞均匀涂布在含有26 μ g/mL卡那霉素的LB固 体培养基上，30°C条件下静置培养48h，待长出菌落后挑取具有卡那霉素抗性的菌落至含有 26 μ g/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，180rpm振荡培养12h后备用；b、吸取上述含有 筛选后的菌株的液体培养基100 μ L，均匀涂布在含有100g/L蔗糖的LB固体培养基上，能 够在该固体培养基上生长的菌株细胞，即为同时具有蔗糖抗性和抗生素抗性的菌株细胞， 挑取具有双重抗性的菌株细胞的单克隆于10mL的液体培养基中，在30°C条件下180rpm振 荡培养12h后备用，采用表1中的引物对过夜菌液进行基因 PCR扩增实验；c、将扩增实验 显阳性的菌株进行液