体扩大培养，以该扩大培养的菌液为模板进行PCR扩增实验；d、将步 骤c中PCR扩增产物序列送北京擎科新业生物技术有限公司进行序列测定，若测序结果与 ncgll221*基因序列相同，贝U证明pK18mobsacB_ Δ ncgll221: :ncgll221*质粒已导入到谷 氨酸棒杆菌59114菌株中，得到了谷氨酸突变菌株5911411(18111(*83〇8-八1?^11221::1?^ 11221*，将该菌株编号为A3。
[0077] 其中，步骤b和c中的PCR扩增实验的体系为：2XPrimeSTARMax Premix，25y L ; ncgll221*F，0. 5μ L ;ncgll221*R，0. 5μ L ;菌液，10μ L ;ddH20,14μ L ;总体系 50μ L ;PCR 扩增条件为：94°C X3min ;94°C X30s ;58°C X30s ;72°C X45sX30 个循环；72°C X5min ; 12。。X 气
[0078] 实施例4
[0079] 本实施例用于说明本发明的谷氨酸生产菌株及其制备方法
[0080] 按照实施例1的方法制备谷氨酸生产菌株，不同的是，步骤（2)中将ncgll221基 因序列的有义链的起始密码子TTG替换为偏好性高的密码子ATG，从而得到经密码子偏好 性改造的基因序列ncgll221 #(SEQ ID No :8)，制得谷氨酸突变菌株ATCC13032-pK18mobsac B-AdtsRl: :ncgll221#，将该菌株编号为 A4。
[0081] 对比例2
[0082] 按照实施例3的方法制备谷氨酸棒杆菌S9114感受态细胞，然后将pK18mobsacB 质粒采用实施例3的方式电击转化谷氨酸棒杆菌S9114感受态细胞，得到已导入空质粒 pK18m〇bsaCB的谷氨酸菌株，将该菌株编号为D2。
[0083] 测试例
[0084] 将实施例1-4制备的谷氨酸突变菌株A1-A4和对比例1-2制备的谷氨酸菌株 D1-D2分别进行发酵验证实验。
[0085] 发酵验证实验具体过程为：分别将冻存于-80°C冰箱中的甘油冻存管中的测序正 确的谷氨酸突变菌株A1-A4和谷氨酸菌株D1-D2100 μ L接种于100mL谷氨酸棒杆菌液体培 养基中进行活化，于32°C下150rpm培养过夜；从该过夜的培养液中吸取20mL液体，接种于 200mL谷氨酸生产种子培养基中，于32°C下200rpm条件下培养10h，制得种子液；
[0086] 以10体积％的接种量分别将上述种子液接种至装有2L谷氨酸生产发酵培养基的 5L全自动发酵罐中，控制发酵罐起始培养温度为32°C，初始通气量为1. 5L/min，初始搅拌 速度为560rpm，发酵过程中相关参数控制如下：
[0087] 温度：采用间隔升温方式控制发酵温度，即控制发酵起始温度为32°C，并且每间 隔4h使发酵温度提高0. 5°C ;
[0088] 溶氧：采用分段式供氧，通过调节通气量及搅拌转速来控制发酵液中的溶氧浓度， 使发酵菌种在发酵延滞期和稳定期至发酵结束溶氧浓度在5% -10%，而在产酸旺盛的对 数生长期溶氧浓度控制在20% -25% ;
[0089] pH :发酵过程中自动流加25重量％的氨水控制发酵液的pH在7. 0-7. 2 ;
[0090] 泡沫处理：根据发酵罐中的泡沫情况流加20% (w/v)浓度的泡敌进行消泡；
[0091] 补料：当残糖含量降至1 %时，采用流加50% (w/v)浓度葡萄糖溶液进行补料；
[0092] 在发酵32h时，采用SBA-40E型葡萄糖-谷氨酸生物分析仪分别测定上述6个发 酵罐中的发酵液产生的L-谷氨酸的产量和葡萄糖的含量，测试结果见表2。采用公式1计 算糖酸转化率。
[0093] 谷氨酸转化率=C谷氨酸XV发酵液A285+500XV流加糖）X 100% 公式1
[0094] 表示发酵结束后发酵液中谷氨酸的浓度；
[0095] 表示发酵结束后发酵液的体积；
[0096] 表示发酵结束后所用流加糖液的总体积。
[0097] 表 2
[0098]
[0099] 通过表2的数据可以看出，实施例1-4与对比例1-2相比，将本发明的方法制得的 谷氨酸生产菌株用于发酵产生L-谷氨酸的含量较高，且糖酸转化率也较高，表明本发明的 方法制得的谷氨酸生产菌株具有较强的产生谷氨酸的能力。
[0100] 分别将实施例1与实施例2、实施例3与实施例4比较可以看出，以促进谷氨酸产 生的基因所对应的全部密码子数为基准，将促进谷氨酸产生的基因的从起始密码子开始的 1-20%密码子替换为偏好性高的密码子；和/或以抑制谷氨酸产生的基因所对应的全部密 码子数为基准，将该抑制谷氨酸产生的基因的从起始密码子开始的1-20%密码子替换为偏 好性低的密码子，能够进一步提高谷氨酸生产菌株产生谷氨酸的能力。
[0101] 本发明中，利用密码子的简并性和生产谷氨酸的野生菌株对不同密码子的偏好 性，将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，和/或 通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子，从而能 够实现在不改变基因组拷贝数和谷氨酸蛋白序列的情况下，提高谷氨酸的产量的发明目 的，制得产生谷氨酸能力较强的谷氨酸生产菌株。
[0102] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0103] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0104] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种谷氨酸生产菌株的制备方法，其特征在于，该方法包括将生产谷氨酸的野生菌 株中编码谷氨酸代谢通路上的酶的基因进行密码子偏好性改造，密码子偏好性改造的方式 为：通过将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，和 /或通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子，得 到经密码子偏好性改造的基因序列。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，以促进谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子 数为基准，将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子的〇. 01-50%替换为偏好性高的密码 子；和/或以抑制谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将抑制谷氨酸产生的 基因所对应的密码子的〇. 01-50%替换为偏好性低的密码子。3. 根据权利要求2所述的方法，其中，以促进谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子 数为基准，将促进谷氨酸产生的基因的从起始密码子开始的1-20%密码子替换为偏好性高 的密码子；和/或以抑制谷氨酸产生的基因所对应的全部密码子数为基准，将该抑制谷氨 酸产生的基因的从起始密码子开始的1-20%密码子替换为偏好性低的密码子。4. 根据权利要求1所述的方法，其中，谷氨酸代谢通路上，促进谷氨酸产生的酶为磷酸 烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶系、柠檬酸合酶和机械应力敏感型谷氨酸 外排蛋白中的至少一种，抑制谷氨酸产生的酶为乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶亚基、α-酮 戊二酸脱氢酶系、乳酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶中的至少一种。5. 根据权利要求4所述的方法，其中，促进谷氨酸产生的酶为机械应力敏感型谷氨酸 外排蛋白，抑制谷氨酸产生的酶为乙酰辅酶Α羧化酶羧基转移酶亚基。6. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述生产谷氨酸的野生菌株为谷氨酸棒 状杆菌（Corynebacteriumglutamicum)、高效棒状杆菌（C.efficiens)和黄色短杆菌 (Brevibacteriumflavum)中的至少一种。7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述生产谷氨酸的野生菌株为谷氨酸棒状杆菌。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述偏好性高的密码子包括：起始密码子 AUG、苯丙氨酸密码子UUC、亮氨酸密码子CUG或CUC、异亮氨酸密码子AUC、缬氨酸密码子 GUU或GUC、酪氨酸密码子UAC、组氨酸密码子CAC、谷氨酰胺密码子CAG、天冬酰胺密码子 AAC、赖氨酸密码子AAG、天冬氨酸密码子GAU、谷氨酸密码子GAA、丝氨酸密码子UCC或UCU、 脯氨酸密码子CCA或CCU、苏氨酸密码子ACC或ACU、丙氨酸密码子GCA或GCU、半胱氨酸密 码子UGC、精氨酸密码子CGC或CGU;所述偏好性低的密码子包括：起始密码子UUG或GUG、苯 丙氨酸密码子UUU、亮氨酸密码子UUA或CUA、异亮氨酸密码子AUA、缬氨酸密码子GUA、酪氨 酸密码子UAU、组氨酸密码子CAU、谷氨酰胺密码子CAA、天冬酰胺密码子AAU、赖氨酸密码子 AAA、天冬氨酸密码子GAC、谷氨酸密码子GAG、丝氨酸密码子AGC或AGU、脯氨酸密码子CCC 或CCG、苏氨酸密码子ACG或ACA、丙氨酸密码子GCG或GCC、半胱氨酸密码子UGU、精氨酸密 码子AGG或AGA。9. 根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括：将经密码子偏好性改造的基因序 列用于构建具有经密码子偏好性改造的基因的质粒，将所述质粒转化生产谷氨酸的野生菌 株的感受态细胞，然后进行菌株筛选，得到谷氨酸生产菌株。10. 根据权利要求1-9中的任意一项所述的方法制备的谷氨酸生产菌株。
【专利摘要】本发明涉及一种谷氨酸生产菌株的制备方法，该方法包括将生产谷氨酸的野生菌株中编码谷氨酸代谢通路上的酶的基因进行密码子偏好性改造，密码子偏好性改造的方式为：通过将促进谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性高的密码子，和/或通过将抑制谷氨酸产生的基因所对应的密码子至少部分替换为偏好性低的密码子，得到经密码子偏好性改造的基因序列。本发明的方法能够在不改变基因组拷贝数和谷氨酸蛋白序列的情况下，提高谷氨酸的产量，制得产生谷氨酸能力较强的谷氨酸生产菌株。
【IPC分类】C12R1/13, C12R1/15, C12N15/74, C12N15/77, C12N1/21
【公开号】CN105441473
【申请号】CN201410405997
【发明人】梁恒宇, 王宏龄, 王晓建, 林海龙, 李辉, 臧传刚, 陈博, 韩隽, 安泰, 李文钊, 熊强
【申请人】中粮营养健康研究院有限公司, 中粮生化能源（龙江）有限公司, 中粮集团有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年8月18日