037] 如图1所示，标号为19、31、68、80、82在322匕?处有明显的亮条，为含抗稻瘟病基因 Pi2的品种，而其他为不含抗稻瘟病Pi2基因的品种。
[0038] 并对此96个水稻品种进行田间稻瘟病抗性鉴定，结果为:标号19、31、68、80、82的 为含抗稻瘟病基因Pi2的品种。
[0039] 经过对比得出，采用所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的方法鉴定的 结果与此田间稻瘟病抗性鉴定一致。
[0040] 实施例2
[0041 ] 准确性测定实验。
[0042] (1)水稻材料
[0043] 水稻品系IRBLz5-CA与丽江新团黑谷(LTH)的F2单株388个单株于2014年早稻种植 于岑溪梨木镇稻瘟病病圃。
[0044] (2)水稻基因组DNA提取
[0045] 插秧后14天分别取种植于384个单株的水稻叶片基因组DNA的提取按(Murray， 1980)的CTAB法进行。
[0046] (3)PCR扩增
[0047] PCR反应体系为20ul的体系，含2.Oul10XBuffer，0.4uldNTP，Pi2Dom两种引物各 1 ·Oul4mol·L-1，0 · 2ulTaq酶，2 ·Oul模板DNA，13 · 8uldd^OJCR反应程序 94°C5min，然后 35 个循环94°〇3〇8,62°〇3〇8,72°〇458，最后72°(3延伸1〇1^11。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中电 泳(90V，20min)，gelred核酸染料染色，紫外灯下观察拍照。
[0048] (4)抗性调查
[0049]插秧后35天，对内群体的叶瘟发病情况进行调查，有稻瘟病典型病斑的记为S，无 典型病斑的记为R。
[0050] (5)结果与分析
[0051 ] 调查结果，水稻品系IRBLZ5-CA表现为抗(R)，LTH表现为感（SK388个单株中，有 296个单株表现为抗（R)，92个单株表现为S，R:S分离比为3:1(卡方0.35)。用分子标记Pi2Dom检测这388个单株，296个抗性单株均有322bp的产物，而92个单株无扩增产物，如图2 所示为其中24个水稻DNA样品的凝胶电泳图，图中有条带的单株对稻瘟病叶瘟表现为抗 (R)，无带的单株对稻瘟病叶瘟表现为感病(S)。从而说明Pi2Dom能100 %准确跟踪抗稻瘟病 基因Pi2。
[0052] 实施例3
[0053] Pi2Dom与其他检测Pi2基因的引物相比所具有的优势对比实验。
[0054] 根据抗病基因的序列，建立与抗病基因紧密连锁的分子标记或显性分子标记。华 丽霞，汪文娟等在"抗稻瘟病Pi2/9/z_t基因特异性分子标记的开发.中国水稻科学.2015， 29(3): 305-310"中，利用抗稻瘟病基因Pi2与日本晴基因组上的等位感病基因序列比对，通 过CAPS/dCAPS的方法建立了基于PCR技术检测的基因特异性分子标记Pi2SNP，高利军等在 "24个抗稻瘟病基因分子标记的建立及在水稻亲本中的分布.第一届中国杂交水稻大会论 文集.2010年9月：294-298"中，利用抗稻瘟病基因Pi2基因序列与日本晴等位基因的序列差 异建立了抗稻瘟病基因的共显性分子标记M-PiSliSSNP和M-Pi2这两个分子标记，特异性 强，辅助选择的准确率高，但是也存在一定的局限性。标记Pi2SNP扩增获得的PCR产物于6% ~8 %的聚丙烯酰胺变性电泳凝胶中电泳检测(90V，120min)，与实施例1的Pi2Dom相比操作 复杂，耗时长，费用高。
[0055] 由于Pi2与Piz-t属于等位基因，用共显性分子标记检测含有Pi2与Piz-t基因的水 稻植株无法具体确定该单株含Pi2和Piz-t中的哪一个基因或者两个基因都含有。用M-Pi2 扩增实施例1表格中的9 6个水稻DNA样品PCR产物于1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测（12 0V， 15min)，结果如图3所示。对图3经抗病鉴定可见，图中编号为9、75为含有抗病基因Piz-t的 植株，而19、31、68、80、82为含有抗病基因？12的植株。而采用本发明的？120〇111引物则能够特 异检测出含有基因Pi2的单株。
[0056] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物，其特征在于：由Pi2DomR 弓丨物和Pi2DomF引物组成，所述Pi2DomR引物为序列表SEQIDN0:1核苷酸序列的引物;所述 Pi2DomF引物为SEQIDN0:2核苷酸序列的引物。2. -种水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记，其特征在于，采用以下步骤： 步骤S1;提取水稻的基因组DNA; 步骤S2:以步骤S1的水稻的基因组DNA为模板，采用如权利要求1所述水稻抗稻瘟病基 因Pi2的特异性分子标记的专用引物对基因组进行PCR扩增，对扩增产物进行1.2%琼脂糖凝 胶电泳以区分是否为含稻瘟病抗病基因Pi2的水稻，含稻瘟病抗病基因Pi2的水稻DNA能扩 增出322bp的条带。3. 根据权利要求2所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记，其特征在于:所述 PCR扩增的反应体系为20ul的体系，包括：10XBuffer2.Oul，dNTPO.4ul，浓度为4mol/L的 Pi2DomR引物和Pi2DomF引物各 1.0ul，Taq酶0.2ul，模板DNA2.0ul，ddH2012.8ul。4. 根据权利要求3所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记，其特征在于:所述 PCR扩增的反应程序为:94°C预变性5min，94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸45s，其中， 变性、退火和延伸三个步骤循环30次，72°C最后一步延伸10min。5. 权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的特异性分子标记的专用引物在水稻育种 中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种水稻抗稻瘟病基因<i>Pi2</i>的特异性分子标记及其专用引物，所述水稻抗稻瘟病基因<i>Pi2</i>的特异性分子标记的专用引物由Pi2DomR引物和Pi2DomF引物组成，所述Pi2DomR引物为序列表SEQ？ID？NO：1核苷酸序列的引物；所述Pi2DomF引物为SEQ？ID？NO：2核苷酸序列的引物。采用本发明的技术方案，使用方法简单，降低了育种成本，而且能快速地检测抗稻瘟病基因<i>Pi2</i>的特异性功能标记，以区分是否为含<i>Pi2</i>抗稻瘟病基因的水稻品种；缩短育种周期，在水稻的分子标记辅助育种中发挥重要作用。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105462971
【申请号】CN201610003181
【发明人】邓国富, 马茜茜, 高利军, 颜群, 戴高兴, 周维永, 李瑞芳, 周萌, 陈仁天, 张晋, 陈小林, 梁海福, 陈韦韦, 李焜华, 陈荣林
【申请人】广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所, 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月5日