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本发明的有益效果为:(1)高效便利:按照本发明方法能够高效、便利的得到含有NV-GII片段病毒样颗粒的标准物质(2)安全:由于病毒样颗粒不具备在复制增殖的能力和传染性，因此不会具有散毒的风险；(3)病毒样颗粒具备病毒的结构，需要进行核酸提取，因此可以对RNA病毒检测的全过程进行监控，避免了由于核酸抽提过程出现的假阴性风险；(4)病毒样颗粒具有耐RNase的优点，解决了RNA标准样品稳定性的问题。(5)该病毒样颗粒在表面人工引入了组氨酸标签，可经过亲和层系进行纯化，方便大规模推广应用。
【附图说明】
[0017]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0018]图1.NV-GII 基因片段电泳图。M: DNA Marker DL2000; 1:阴性对照1; 2: RT-PCR产物。
[0019]图2.NV-GI1- VLPs 提取RNA鉴定电泳图。.Μ: DNA Marker DL2000 ； 1: PCR产物；2:阴性对照。
[0020]图3.不同保存温度NV-GI1-VLPs的稳定性测试。
[0021 ]图4.NV-GI1- VLPs DNA荧光定量PCR检测。
[0022]图5.NV-GI1- VLPs RNA荧光定量PCR检测。
[0023]图6.草莓浆果中NV-GI检测。
【具体实施方式】
[0024]实施例1 制备NV-GI1- VLPs
含有NV-GII基因的病毒样颗粒标准物质的制备方法，包括以下步骤:
(1)含有组氨酸标签的VLPs重组质粒pET-NH-MS2his的构建
将pET32a质粒使用Xba I和Nco I消化，去除其中的Xba I和Nco I两个酶切位点间的序列，将人工合成的5 ’ -P04-CTAGATTACAAGGC-3 ’ 和5 ’ -P04-CATGGCCTTGTAAT-3 ’ 两条互补的寡核苷酸复性后插入其中，构建重组质粒pET-NH，测序鉴定。
[0025]采用一步法扩增试剂盒以MS2Pfl和MS2Prl为引物，以MS2 RNA为模板扩增MS2目的片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒(TaKaRa)回收目的片段，用50yL ddH20洗脱，标记为MS2 DNA。
[0026]采用OneStep RT-PCR，以得到的MS2 DNA为模板，分别用引物MS2Pfl和ms2hispr和ms2hispf和MS2Prl扩增MS2上和MS2下2个DNA片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收后，存于4°C备用。再以2个片段的混合物为模板，以MS2Pfl和MS2Prl为引物做PCR，得到引入了编码组氨酸标签序列的MS2 DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收后的PCR产物命名为MS2his。
[0027]分别将制备的pET-NH载体和回收的MS2his片段用限制性内切酶BamHI和Hind ΙΠ进行酶切消化。将双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收后与PET-NH载体用Solut1nI连接酶进行连接。连接产物转化DH5a感受态细胞，挑取单菌落作进行酶切鉴定。从平板培养基上挑选单菌落接种至5 ml的含有Amp抗生素的液体培养基中，37°C振荡培养12-16小时，参照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取。以提取的质粒为模板，以MS2Pf和MS2Pr为引物进行PCR扩增。将PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。若可见载体与
1700 bp左右的MS2目的片段即为阳性。
[0028](2)构建原核表达载体 pNH-MS2his-NV_GII
按RNA提取试剂盒说明书的方法提取NV总RNA作为模板扩增NV-GII蛋白基因，RT-PCR体系为:5XRT-PCR buffer 5yL，dNTP mix lyL,Enzyme Mix lyL，引物NF和NR各lyL，RNA模板5yL，ddH20补足25 yL，反应条件为，50°C反转录30min，95°C灭火变性lOmin，然后95°C lmin，55°C lmin，72°C 1 min，40个循环，最后72°C延伸10 min。扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见430bp左右条带(图1)，宝生物凝胶回收试剂盒回收NV-GII蛋白片段。
[0029]Hindm和Notl双酶切pNH_MS2his和NV-GII蛋白片段，胶回收试剂盒回收酶切的pNH-MS2his和NV-GII蛋白片段，回收产物16°C连接过夜。连接体系为载体pNH-MS2his和NV-GII蛋白片段分别为2 yL和6 yL，T4 DNA连接酶1 yL，10 XT4连接酶buffer 1 yL。连接产物转化DH5a感受态细胞，将涂板后获得的重组克隆进行PCR鉴定。将阳性克隆菌种送测序，鉴定为阳性的重组载体命名为pNH-MS2h is-NV-G 11
(3)诱导及纯化重组pNH-MS2his-NV-GII质粒
将测序正确的pNH-MS2his-NV-GII质粒转化表达菌株BL2UDE3)，将阳性克隆菌株接种于氨苄抗性的LB液体培养基中，37°C振荡培养至0D600=0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导表达6 h。离心收集菌体。菌体中加入裂解缓冲液重悬，于冰上放置30min，离心去除菌体碎片，将上清加入预装有N1-NTA的纯化柱中，使液体自然流出，加入3倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤2次，然后加入洗脱缓冲液将病毒样颗粒洗脱，命名为NV-GI1-VLPs。。
[0030]实施例2 NV-GI1-VLPs的特性检测
对含有NV-GII基因的病毒样颗粒标准物质的特性检测，步骤如下:
(1 )NV-GI1-VLPs 中 RNA 的提取及 RT-PCR 检测
将纯化的病毒样颗粒溶液100yL提取RNA作为模板，以权力4中NV-GII引物和探针序列进行RT-PCR扩增，RT-PCR体系为:5XRT-PCR buffer 5yL，dNTP mix lyL,Enzyme Mix lyL,引物NF和NR各lyL，RNA模板5yL，ddH20补足25 yL，反应条件为，50°C反转录30min，95°C灭火变性lOmin，然后95°C lmin，55°C lmin，72°C 1 min，40个循环，最后72°C延伸 10 min。扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，可见89bp左右的条带(图2)，送测序。
[0031 ] (2)NV-GII_VLPs 耐 RNaseA 的检测
取2份50yL经N1-NTA的纯化的表达产物:第一份加100U RNaseA，第二份不加酶，37°C保温1 h后，提取核酸作为模板，使用荧光定量RT-PCR进行检测，每份重复3次，记录Ct值，统计结果显示无显著差异。结果表明:NV-GI1-VLPs耐酶性良好，纯化得到了含有NV-GII基因的VLPs ο
[0032](3)NV-GII_VLPs 稳定性检测
将纯化的病毒样颗粒分别放置在4°C、_20°C放置1个月，期间每5天进行一次荧光定量RT-PCR检测，记录Ct值。结果显示，在1个月保存期内，病毒样颗粒的浓度没有明显的变化，在不同的温度下也没有明显的区别(图3)，结果表明，制备的NV-GI1-VLPs的稳定性良好。
[0033](4)NV-GI1-VLPs DNA荧光定量PCR检测
分别以提取NV-GI1-VLPs的RNA、NV-GI1-VLPs为模板，按照NV-GI I的引物和探针序列进行PCR扩增，可以看到都未起峰，结果表明NV-GI1-VLPs构建成功，纯化得到的NV-GI1-VLPs检测不至IJDNA，能够排除DNA的干扰图4。
[0034](5)NV-GI1-VLPs RNA荧光定量PCR检测
分别以提取NV-GI1-VLPs的RNA、NV-GI1-VLPs为模板，按照NV-GI I的引物和探针序列进行RT-PCR扩增，提取NV-GI1-VLPs的RNA起峰，未提取RNA的NV-GI1-VLPs没有起峰。结果表明，成功包裹了NV-GI1-VLPs的RNA，结果见图5。
[0035]实施例3草莓浆果中的诺如病毒RNA检测应用
以NV-GI1-VLPs作为质控样品，检测草莓浆果中的诺如病毒RNA，步骤如下:
(1)果蔬浆果中病毒的富集
取5-10个草莓或25g检测样品，加入bagpage中；加入35 mL TGBE缓冲液及30U的果胶酶黑曲霉，同时加入大肠杆菌噬菌体MS2标准样品100 yLo
[0036]a)在室温下60rpm恒定摇晃孵育20 min。
[0037]备注:对于酸性软水果，在孵育过程中，应以10 min的间隔监测洗脱液的pH值。如果pH值低于9.0，则用NaOH溶液调节至9.5。若调节了pH值，则应该延长10