0Hz，1H)，2. 99 (s，1H)，2. 91 (q，J = 6. 0Hz，2H)，1. 48(m，2H)，1. 24(m，2H)，1. 16(m，2H)。
[0025] 实施例4制备（3R，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮（4)
[0026] 将 0· 112g(0. 25mmol)化合物（3R，6R)-3-(4-丁氨基苄基）-6-(吲噪-3-乙基）-哌 嗪-2, 5-二酮（3)置于50mL反应瓶中，加入10mL甲醇溶解，向溶液中加入20mg Pd/C，通 入H2，室温搅拌反应48小时，TLC显示原料的基本消失，滤去Pd/C，减压浓缩得5lmg (65% ) 标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e) :315[Μ+Η]+·Μρ 188-189°C. [α]3=+ 10.0,（c = 0· 29, CH30H). 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) : δ/ppm = 1〇· 93(s，1Η)，8· 04(s，1Η)，7· 94(s，1Η)， 7. 57(d，J = 9. 0Hz，1H)，7. 30(d，J = 9. 0Hz，1H)，7. 02(t，J = 6. 0Hz，2H)，6. 92(t，J = 6. 0Hz，1H)，4. ll(s，1H)，3. 50(s，1H)，3. 38(dd，J = 6. 0Hz，J = 15. 0Hz，1H)，3. 00(dd，J = 6.0Hz，J = 15.0Hz，1H)，2.23 (m，2H)，1.01 (m，3H)，0.59 (m，3H).13C NMR(75MHz，DMS0-d6): δ/ppm = 167. 48,167. 40,136. 37,128. 35,125. 08,121. 10,119. 45,118. 71，111. 58， 109.01,55. 86,54. 44,33. 64,32. 56,29.27,21. 19. Elem. Anal ：C17H22N402. C, 64. 95 ；H,7. 05 ； N, 17. 82〇
[0027] 实验例1SDS-PAGE凝胶电泳分析（3R，6R) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌 嗪-2, 5-二酮对UK激活纤溶酶原活性的影响
[0028] 1)主要试剂和仪器
[0029] 试剂：SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂及氨基己酸（EACA)均为市售试剂；
[0030] 人纤溶酶原（PLG)和尿激酶（UK)购自Sigma公司。
[0031] 仪器：垂直电泳槽 Mini-PROREN Tetra System (BI0-RAD);
[0032] 电泳仪 Power Pac (BIO-RAD);
[0033] 扫描仪 Scanmaker 8700 (MICROTEK) 〇
[0034] 2)溶液的准备
[0035] PLG溶液的配制：称取PLG 5mg，置于15mL离心管中，加入lmL生理盐水溶解即得 PLG溶液，浓度为5mg/mL ;分装，每管0. lmL，-20°C保存待用；
[0036] UK溶液的配制：将整瓶UK (100, 000U)以10mL生理盐水溶解，得母液；取0· lmL母 液以生理盐水稀释至2. 5mL，得UK溶液，浓度为400U/mL ;分装，每管0. lmL，-20°C保存待 用；
[0037] EACA溶液的配制：称取50mg化合物，以lmL生理盐水溶解，即得母液1，浓度为 50mg/mL ;取0. 5mL母液1，以生理盐水稀释至lmL，得溶液2,浓度为25mg/mL ;
[0038] 化合物4溶液的配制；称取5mg化合物4,以lmL生理盐水溶解，浓度为5mg/ mL;-20°C保存待用。
[0039] 3)样品的准备
[0040] 取5yL UK溶液，置于0. 5mL离心管中，再向其中分别加入10yL生理盐水或待测 化合物溶液，37°C孵育15分钟；再向各离心管中分别加入5 μ L PLG溶液，37°C孵育15分 钟；孵育结束后，再向各离心管中分别加入5 yL 5XSDS电泳上样缓冲液，混匀后将各离心 管于100°C水浴中变性5分钟，快速冰浴冷却后以12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离。
[0041] 4) SDS-PAGE 凝胶电泳
[0042] 试剂准备：
[0043] 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr) 29. 0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis) 1. 0g，混匀后加超 纯水（up-H20)，37°C溶解，定容至100mL，棕色瓶存于室温；
[0044] 1. 5M Tris-HCl (pH 8. 0) :Tris 18. 17g 加 up-H20 溶解，浓盐酸调 pH 至 8. 0,定容 至 100mL ;
[0045] 1]\11^8-!1(：1(口!16.8):1^8 12.118加即-!120溶解，浓盐酸调口!1至6.8，定容至 100mL ；
[0046] 12%SDS:电泳级SDS 12. 0g加 up-H20于68°C助溶，浓盐酸调至pH 7. 2,定容至 100mL ；
[0047] 10%过硫酸铵仏?）：10〇11^八？加即-!120 11^;
[0048] 考马斯亮兰染色液：甲醇-水-醋酸=45mL+45mL+10mL，加入100mg考马斯亮蓝 固体，配制成染色液；
[0049] 脱色液：甲醇-水-醋酸=10mL+90mL+10mL，配制成脱色液。
[0050] 操作步骤：
[0051] 采用垂直式电泳槽装置
[0052] (一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
[0053] 1.分离胶（12% )的配制：
[0054] 超纯水 4. OmL
[0055] 30 %储备胶溶液3. 3mL
[0056] 1. 5M Tris-HCl 2. 5mL
[0057] 12% SDS 0. lmL
[0058] 10% AP 0. lmL
[0059] 取lmL上述混合液，加 TEMED(N，N，N'，Ν' -四甲基乙二胺）10yL封底，余加 TEMED4yL，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平，凝胶完全聚合需大约60min.
[0060] 2.浓缩胶（4 % )的配制：
[0061] 超纯水 1.4mL
[0062] 30 %储备胶溶液0· 33mL
[0063] 1M Tris-HCl 0. 25mL
[0064] 12% SDS 0. 02mL
[0065] 10% AP 0. 02mL
[0066] TEMED 2 μ L
[0067] 将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需大 约 30min。
[0068] (二）样品处理：将样品加入相应量的5XSDS上样缓冲液，100°C加热3-5min使 蛋白变性，取出，快速降温。
[0069] (三）上样：将处理后的样品加入样品池中，并加入20yL蛋白分子量标准品作对 照。
[0070] (四）电泳：在电泳槽中加入IX电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电 泳时，浓缩胶电压80V，30min，分离胶电压100V至电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需 1. 5h)〇
[0071] (五）染色：将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，于摇床^ORPM)室温 10min〇
[0072] (六）脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，于摇床^ORPM)室温脱色过夜。
[0073] (七）将脱色后的胶用扫描仪扫描，观察结果。
[0074] 5)评价结果见图2。
[0075] 实验例2Transwell小室实验评价（3R，6R) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲噪-3-乙 基）-哌嗪-2, 5-二酮对HCCLM3细胞侵袭能力的影响
[0076] 1)受试样品
[0077] (31?，61?)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2,5-二酮用含0.1%0130 的DMEM培养基配制成50 μ Μ浓度；
[0078] RGDS用含0· 1 % DMS0的DMEM培养基配制成100 μ Μ浓度。
[0079] 2)细胞株
[0080] HCCLM3 (高转移人肝癌细胞），购自ATCC。
[0081] 3)主要仪器及耗材
[0082] 超净台：VS-1300-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；
[0083] 细胞孵育箱：INC153, memmer公司；
[0084] 显微镜：Zeiss公司；
[0085] 8