. 0 μ m孔径的Transwell小室、12孔细胞培养板和25cm2培养瓶：Coming Costar 公司。
[0086] 4)主要试剂
[0087] DMEM培养基干粉：Gibco公司；
[0088] PBS 缓冲液：每 1L 溶液中含有 NaCl 8. 2g、KC1 0· 2g、Na2HP04 · H20 1. 56g、ΚΗ2Ρ04 0· 2g，PH 值 7. 4 ;
[0089] 胎牛血清：Hyclone公司；
[0090] 0· 25%胰酶溶液：Hyclone 公司；
[0091] 青霉素、链霉素：石药集团中诺药业（石家庄）有限公司；
[0092] DMS0 (二甲基亚讽）：Hyclone 公司；
[0093] Matrigel (基质胶）：BD 公司；
[0094] 结晶紫染液：碧云天公司。
[0095] 5)评价方法
[0096] 包被基质胶：将冻存于-20°C冰箱的matrigel 4°C过夜，变成液态；取720 μ L无 血清DMEM培养基，加入180 μ L Matrigel，混勾，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室， 100以17个；放入37°(：、5%〇)2培养箱中，孵育511 ;
[0097] 水化基底膜：吸除小室中残留液体，每孔加入50 μ L的DMEM培养基，37°C、5% C02 培养箱中孵育30min ;
[0098] 接种细胞：消化HCCLM3细胞，无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密 度为5 X 105个/mL ;每孔加入100 μ L细胞悬液，同时加入药物25 μ L，使化合物终浓度为 10 μ M，RGDS终浓度为20 μ Μ ;下室加入600 μ L的含10 % FBS的DMEM培养基，在37 °C、5 % C02培养箱中培养48小时；
[0099] 结晶紫染色：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；用4%的多聚甲醛固定细胞 30min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0. 1 %的结晶紫染液染色30min，吸除染色液，用PBS 洗3次；
[0100] 计数：在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数；实验数据统计采用t 检验，细胞数以G±sd个）表示。
[0101] 6)评价结果
[0102] 表 1. (3R，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2,5-二酮⑷对HCCLM3 细胞侵袭能力的影响a
[0103]
[0104] a)n = 3 ;b)与 NS 组比，p < 0· 05。
[0105] 实验例3Transwell小室实验评价（3R，6R) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲噪-3-乙 基）-哌嗪-2, 5-二酮对HCCLM3细胞迀移能力的影响
[0106] 1)受试样品
[0107] (31?，61?)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2,5-二酮用含0.1%0130 的DMEM培养基配制成50 μ Μ浓度；
[0108] RGDS用含0. 1 % DMS0的DMEM培养基配制成100 μ Μ浓度。
[0109] 2)细胞株
[0110] HCCLM3 (高转移人肝癌细胞）。
[0111] 3)主要仪器及耗材
[0112] 超净台：VS-1300-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；
[0113] 细胞孵育箱：INC153, memmer公司；
[0114] 显微镜：Zeiss公司；
[0115] 8. 0 μ m孔径的Transwell小室、12孔细胞培养板和25cm2培养瓶：Corning Costar 公司。
[0116] 4)主要试剂
[0117] DMEM培养基干粉：Gibco公司；
[0118] PBS 缓冲液：每 1L 溶液中含有 NaCl 8. 2g、KC1 0· 2g、Na2HP04 · H20 1. 56g、 KH2P040 . 2g，PH 值 7. 4 ;
[0119] 胎牛血清：Hyclone公司；
[0120] 0· 25%胰酶溶液：Hyclone 公司；
[0121] 青霉素、链霉素：石药集团中诺药业（石家庄）有限公司；
[0122] DMS0 (二甲基亚讽）：Hyclone 公司；
[0123] 结晶紫染液：碧云天公司。
[0124] 5)评价方法
[0125] 接种细胞：消化HCCLM3细胞，无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密 度为2 X 106个/mL ;每孔加入100 μ L细胞悬液，同时加入药物25 μ L，使化合物终浓度为 10 μ M，RGDS终浓度为20 μ Μ ;下室加入600 μ L的含10 % FBS的DMEM培养基，在37 °C、5 % C02培养箱中培养6小时；
[0126] 结晶紫染色：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；用4%的多聚甲醛固定细胞 30min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0. 1 %的结晶紫染液染色30min，吸除染色液，用PBS 洗3次；
[0127] 计数：在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数；实验数据统计采用t 检验，细胞数以（? 士SD个）表示。
[0128] 6)评价结果
[0129] 表 2. (3R，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2,5-二酮⑷对HCCLM3 细胞迀移能力的影响a
[0130]
[0132] a)n = 3 ;b)与 NS 组比，p < 0· 05。
[0133] 实验例4 (3R，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮（4)体内 抗肿瘤转移评价
[0134] 1)实验材料
[0135] 受试化合物：（31?，61?)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2,5-二酮（4);
[0136] 阴性对照为生理盐水；
[0137] 实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠，体重18-22g，由北京维通利华实验动物技术 有限公司提供；每10只小鼠一组，空白和阳性对照各一组；
[0138] 溶剂：生理盐水。
[0139] 2)药物配制
[0140] 按量称取化合物4,加入生理盐水至所需浓度即可。
[0141] 3)给药剂量及给药方式
[0142] 给药剂量：（3R，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮（4)为 5 μ mol/kg ;按照小鼠体重，每10g给0. lmL药液或者生理盐水；口服给药。
[0143] 4)小鼠 Lewis肺癌模型的建立
[0144] Lewis小鼠肺癌细胞（LLC)，购自ATCC。选用DMEM培养基，其中含10%经灭活的 胎牛血清、1X 105U/L青霉素和100mg/L链霉素。按照贴壁细胞培养方法，每两天传代一次， 富集细胞。
[0145] 待细胞生长状态良好、处于对数生长期时，消化细胞。用生理盐水调整细胞浓度至 1\10 7个/11^，胎盘蓝（1'巧&11131116)染色计数，活细胞数>95%。取近交系0578176雄性小 鼠，左手固定小鼠，用75 %乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持lmL无菌注射器于小鼠腋 部皮下注射LLC肿瘤细胞悬液0. 2mL/只。小鼠接种后10天可以长出直径约4-5mm的肿瘤， 作为瘤源备用。
[0146] 5) Lewis肺癌转移模型的建立
[0147] 取接种8-10天生长良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，脱颈椎处死，用75%的乙醇浸泡 消毒lOmin，在超净工作台上剥离瘤体，选择生长良好的肿瘤组织，在无菌平皿中剪碎，放 置于玻璃组织匀浆器内，按瘤块重（g):生理盐水体积（mL)为1 : 3的比例加入4°C预冷的 生理盐水轻轻研磨，制成细胞悬液，过200目细胞筛制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞 浓度至1 x 1〇7个/mL，胎盘蓝（Tryanblue)染色计数，活细胞数> 95%。
[0148] 取近交系C57BL/6雄性小鼠，左手固定小鼠，用75%的乙醇消毒小鼠右前肢腋窝 皮肤，右手持lmL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液0. 2mL。接种后10天可以长 出直径约4-5_的肿瘤，测量肿瘤体积，按肿瘤平均体积随机分组。
[0149] 从接种肿瘤第11天开始给药，共给药11次，每隔两天测量并记录肿瘤体积。第22 天测量瘤体积后，脱颈椎处死，取出肿瘤称重，并记录肿瘤的肺部转移率和转移瘤结数。
[0150] 6)统计方法
[01