一株可降解环烷酸的芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株可降解环烷酸的芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 石油中的酸性物质包括环烷酸、芳香酸、脂肪酸和酚类等，这些酸性物质总称为石 油酸。其中，环烷酸最为重要，约占石油酸总质量的90%以上。因此，在石油工业中通常不加 区分，将石油酸称为环烷酸。环烷酸的化学成分复杂，通常由多种脂肪族羧酸和具有支链的 单环或多环的脂环羧酸构成。环烷酸的经验通式SC nH2n+Z02,式中η为碳数（一般为11~ 30) ;Ζ为氢不饱和度，为0或负的偶数。
[0003] 环烷酸废水污染是近年来伴随石油工业发展而产生的一种新环境问题。环烷酸是 石油的天然组分，其含量越高，商业价值越低。目前，随着世界范围内高品质石油储量的不 断减少，人们越来越多地把目光投向环烷酸的含量较高的重原油和含油沥青砂等。但是，重 原油和含油沥青砂提炼过程会产生大量有毒的环烷酸。环烷酸是炼油厂污水和油砂处理污 水中毒性最强的成分之一。环烷酸对细菌、浮游植物、浮游动物、鱼类、高等植物和哺乳动物 等多种具有生物毒性。环烷酸废水特别是对水生生物危害较大，对水生态系统和人类健康 具有潜在危害，如何有效处理环烷酸废水问题已引起国际社会和科学界的关注。
[0004] 环烷酸化学性质稳定、难降解。采用絮凝气浮、光解法、臭氧氧化等物理和化学方 法处理环烷酸废水不仅费用高而且难以实现大规模处理。微生物转化降解既是自然环境中 有机污染物转化的重要途径，也是有机污染物污染控制与污染环境修复的有效技术方法， 具有费用低、效果好、无二次污染和有利于大规模实施等特点。因此，寻找具有降解环烷酸 的微生物对于处理环烷酸废水有重要意义。
[0005] 目前，有关环烷酸微生物降解研究主要集中于国外，国内的相关研究的报道较少， 尚处于起步阶段。已有关环烷酸微生物降解的研究主要围绕降解菌株的分离和代谢途径 等。环烷酸的微生物降解以细菌好氧降解为主，目前已经报道的环烷酸的降解细菌主要包 括Arthrobacter sp·，Acinetobacter anitratum，Alcaligenes faecal1 is，Pseudomonas， Corynebacterium cyclohexanicum?Trichosporon cutaneum，Cupriavidus，Rhodococcus 和Dietzia等。这些细菌多以降解单一结构的环烷酸为主。为此，亟待研发能降解多种环烷 酸的降解菌，从而为采用生物降解方法处理大规模环烷酸废水提供有效的菌种资源。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一株可降解环烷酸的芽孢杆菌。
[0007] 本发明所提供的芽孢杆菌是从国内油田采油厂的土壤中筛选得到的。根据其形态 特征、培养特性、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析等证实属于芽孢杆菌属 (Bacillus)，将其命名为錯状芽抱杆菌Bacillus cereus CR1。该菌株已于2013年3月25日 保藏于中国微生物菌种保藏中心管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为:北京市 朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC No. :7638。
[0008] 蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus CR1为革兰氏阳性菌，在LB琼脂平板培养基上，30 °C，培养24h，形成圆形、扁平、光滑、边缘整齐的乳白色菌落(似蜡烛样颜色）、直径为5-7mm。 錯状芽孢杆菌Bacillus cereus CR1属于兼性好氧。生长温度范围20~45°C，最适生长温度 为30°C，可生长pH范围为4.0-10.0，最适生长pH值为7.2。
[0009] 蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus CR1的16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示， 与已发表的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus ATCC14579(T)的16S rRNA基因序列的同源性 分别为99.92 %。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种降解环烷酸的方法。
[0011] 本发明所提供的降解多环烷酸的方法，是用所述蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus CR1对含有环烷酸的样品进行处理，使环烷酸得到生物降解。
[0012] 上述方法中，所述的环烷酸为反-4-甲基-环己烷甲酸、顺-4-甲基-环己烷甲酸、 反-4-叔丁基环己羧酸、反-4-戊基环己烷甲酸、二环己基乙酸。
[0013]以錯状芽孢杆菌Bacillus cereus CR1为活性成分制备的生物制剂也属于本发明 的保护范围。
[0014]本发明的錯状芽孢杆菌Bacillus cereus CR1，分离自石油污染土壤。錯状芽孢杆 菌Bacillus cereus CR1能以5种不同化学结构的环烧酸为唯一碳源和能源进行生长。在不 填加任何碳源的无机盐培养基中，144h内对含量为100mg/L反-4-甲基-环己烷甲酸和反-4-戊基环己烷甲酸的降解效率分别为93.2%和44.6%。因此，本发明提供蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus CR1对于含有高浓度环烷酸废水的生物治理或生物修复的巨大潜力。
[0015] 下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明作进一步说明，并非对本发明的限 制。
【附图说明】
[0016] 图1为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus CR1的扫描电镜图片(A)及其在LB平板下生 长的菌落形态照片(B)
[0017] 图2为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus CR1的16S rRNA基因序列的系统发育分析 图
[0018] 图3为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus CR1对反-4-甲基环己烷酸的降解曲线图
[0019]图4为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus CR1对反-4-戊基环己烷甲酸的降解曲线图
【具体实施方式】
[0020] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0021] 下述实验方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基中的溶剂均为蒸馏水。
[0022] 环烷酸的检测方法采气相色谱-质谱测定。
[0023] 样品处理：取5mL样品，用5mL的二氯甲烷分别以2.5mL、1.5mL和lmL重复萃取3次， 合并有机相并通过无水硫酸钠柱脱水，最后用二氯甲烷定容到10mL。
[0024]采用美国安捷伦气-质联用仪，色谱柱为DB-35ms型。初始温度:80°C;升温程序:80 °C，以10°C/min的速度升温至180°C;进样口温度:270°C;载气为He;流量：1. OmL/min;分流 进样;采用离子监测模式;扫描时间100s。
[0025] 实施例1.蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus CR1的分离、纯化和鉴定。
[0026]錯状芽孢杆菌Bacillus cereus CR1分离自国内油田采油厂的土壤，具体富集、分 离、纯化过程如下：
[0027] 基础无机盐培养基（MSM培养基）组成为：KH2P〇4 1.36g，（NH4)2S〇4〇.66g， Na2HP〇4〇.43g，MgS〇4· 7H20 0.25g，微量元素溶液 10mL，蒸馏水990mL。
[0028] 微量元素溶液的组成为：Ca(N03)2 · 4H20 800mg/L、FeS〇4 · 7H20 400mg/L、CuS〇4 · 5H20 80mg/L、ZnS〇4 · 7H20 40mg/L、MnS〇4 · 4H20 40mg/L、NaM〇4 · 2H20 8mg/L、H3B03 6mg/L、 K2HP〇4 500mg/L，其余为蒸馏水。
[0029] MSM培养基中加入质量百分含量为1.5-1.8 %的琼脂糖，在0.06MPa条件下灭菌 20min。随后待灭菌MSM的培养基冷却至50-60°C后，加入反-4-甲基-环已烷酸，使其浓度为 50mg/L。同时将不含环已烷酸