；萨尔诺夫斯基(Sarnovsky,R.)等人，《癌症免疫学与免疫疗法》(Cancer Immunol Immunother59: 737-746(2010))。虽然Cholix的这个远端部分与PE相比36% -致 并且50%相似，但针对PE的这种相同远端部分具有中和免疫应答的、在动物中产生的多克 隆抗血清连同来自患者的血清不能与Cholix的这种后面的部分发生交叉反应。同样，针对 这种Cholix产生的抗血清不能与PE发生交叉反应。这些数据表明，尽管PE和Cholix两者都 通过相似的机制而共有使细胞中毒的能力，并且这两种蛋白质共有共用的核心结构，但在 它们的在这些蛋白质表面表达的元件方面有引人注目的差异。
[0016] 由于使用PE的先前研究已经在体外和体内证明了这种毒素易于转运穿过上皮细 胞的极化单层而没有毒性作用;Mrsny,R.J.，等人，《当代药物发现》(Drug Discov Today,7 (4) :p.247-58(2002))，诸位发明人已经开始研究，以进一步评估Cholix的特性和生物学， 同时特别集中在Ch 〇 I i X的近端部分的功能方面;确切地说，结构域I和II促进转运穿过肠上 皮单层的用途。由于结构域I和IIa显得是用于上皮转胞吞作用所需要的PE的唯一必需元 件，特别重要的是检验Cholix中的这些相同的结构域。如前所述，在将被认为是结构域I和 IIa的一部分的大多数区域上仅有约15%-25%氨基酸同源性。诸位发明人通过以下一系列 的研究来检验这些结构域:在将Cholix施用至上皮表面后体内监测其生物学分布;体外评 定ChoIix穿过极化上皮细胞单层的跨细胞转运特征；并且将生物活性负荷进行递送，在 Cholix蛋白C末端处该负荷基因整合到该Cholix蛋白中。通过将Cholix的前两个结构域(氨 基酸1-386)与绿色荧光蛋白（GFP)进行基因融合、或者通过将这些表达的结构域化学连接 至IOOnm直径的乳胶珠而产生的初步数据证明：附接至IOOnm的乳胶珠上的ChoI iX在体外和 体内被观察到穿过肠上皮单层而转运。在转胞吞过程期间和之后保留其荧光性质的GFP负 荷还支持这样的论点= Cholix采用非破坏性的（或特许的）运输路径通过极化的上皮细胞。 这个结果良好地预示它的(重复的)作为递送生物活性负荷穿过身体上皮屏障(例如在呼吸 道和胃肠道中的那些）的工具的应用。
[0017] 根据初步研究同样重要地注意的是这样的观察，该观察表明在PE与Chol ix之间的 细胞受体相互作用的明显差异。如前所述，在PE的结构域I结合至膜蛋白α2_巨球蛋白（一种 也称为低密度脂蛋白受体相关蛋白I(LRPl)或CD91的蛋白质）之后PE进入上皮细胞。虽然对 于Cholix的表面受体的确切身份还未确立，初步研究表明Cholix不会使一些表达⑶91的细 胞系中毒，但是使确实表达CD91的一些细胞系中毒。当前不清楚的是，除了CD91，哪些其他 受体可能涉及PE的上皮转胞吞作用。虽然如此，Cholix和PE显得具有不同的细胞受体相互 作用，证明了这样的明显差异，这些差异足以表明对于口服生物制剂和生物活性剂的细胞 内递送两者而言非常不同的和不曾预料的应用。
[0018] 发明概述
[0019] 本发明是基于Cholix的膜运输特性以及Cholix有效地转运穿过气道和肠的极化 上皮细胞的证明，表明了 Cholix衍生的多肽序列(包括蛋白质的近端元件)可以用于蛋白质 和纳米颗粒的有效转胞吞作用，代表了用于新颖药物施用的一种策略。
[0020] 这样，本发明的一方面是提供分离的递送构建体（例如基因融合体或化学构建 体），这种递送构建体包含转运蛋白结构域(例如，Cholix衍生的多肽序列）以及负荷。转运 结构域以及负荷两者可以按变化的化学计量比和空间组织而表达/连接。不同的负荷还可 以在相同的构建体上表达/连接。在优选实施例中，这样的负荷可以包括以下各项中的一项 或任何项:蛋白质、肽、小分子、s iRNA、PNA、miRNA、DNA、质粒、以及反义分子。
[0021] 本发明的另一个方面是在没有注射的情况下提供递送负荷(例如大分子)的能力。
[0022] 本发明的另一个方面是提供将负荷（例如但不限于大分子、小分子、siRNA、PNA、 miRNA、DNA、质粒以及反义分子)递送至需要它们的活性的细胞内区室中的能力。
[0023] 本发明的另一方面是提供:经由基于纳米颗粒和/或树枝状化合物的载体的递送 将负荷转运穿过生物膜。
[0024] 考虑用于本发明的给药/递送的方法包括，例如口服给药、肺部给药、鼻内给药、颊 部给药、舌下给药、眼部给药(包括但不限于递送至玻璃体、角膜、结膜、巩膜、以及眼前房和 后房）、局部施用、注射(有针或无针）、静脉输注、微针施用、经由药物储库(drug depot)制 剂的给药、经由鞘内施用的给药、经由腹膜内施用的给药、经由关节内施用的给药、细胞内 递送、跨血脑屏障的递送、跨血视网膜屏障的递送、用于局部递送和作用的给药、和/或用于 全身递送的递送。
[0025] 在又另一方面，本发明提供了药物组合物，该组合物包含递送构建体以及药学上 可接受的载体。
[0026]本发明还提供了以下公开内容：
[0027] 项目1. 一种分离的递送构建体，该构建体包括转运蛋白结构域和负荷，所述构建 体能够将所述负荷递送至靶向的细胞内区室中。
[0028] 项目2 . -种分离的递送构建体，该构建体包括转运蛋白结构域和大分子，所述构 建体能够在没有注射的情况下将所述大分子递送至受试者的生物区室中。
[0029] 项目3.根据项目1或2中任一项所述的构建体，进一步包括可裂解接头。
[0030] 项目4.根据项目1或2中任一项所述的构建体，其中所述转运蛋白结构域包括 Cholix衍生的多肽序列。
[0031] 项目5.根据项目1所述的构建体，其中所述负荷选自下组，该组由以下各项组成： 大分子、小分子、s iRNA、PNA、miRNA、DNA、质粒以及反义分子。
[0032]项目6.如项目1所述的构建体用于将负荷递送至靶向的细胞内区室中的用途。
[0033] 项目7.如项目1所述的融合体或构建体用于将负荷经由基于纳米颗粒和树枝状化 合物的载体而穿过生物膜的递送的用途。
[0034] 项目8.如项目6所述的基于纳米颗粒和树枝状化合物的载体用于穿过生物膜递送 负荷的用途，这些载体是用转运蛋白结构域修饰的，具有或不具有接头。
[0035] 项目9. 一种药物组合物，包括根据项目1-5中任一项所述的递送构建体和药学上 可接受的载体。
[0036] 项目10.-种编码递送构建体的多核苷酸，所述递送构建体包括转运蛋白结构域 和负荷，所述构建体能够将所述负荷递送至靶向的细胞内区室中。
[0037] 项目11. 一种表达载体，包含如项目10所述的多核苷酸。
[0038]项目12.-种分离的宿主细胞，包含如项目11所述的表达载体。
【附图说明】
[0039] 图1描绘了用于ntCholix的C末端修饰以促进与负荷融合的策略的概述，在这种情 况下，该负荷是Alexa488荧光染料。
[0040] 图2描绘了 ntCholiX-Alexa488?体外穿过极化的肠上皮细胞的转运。Caco-2细胞 单层暴露于测试物质中持续4小时。通过对存在于样品中的荧光的标准曲线分析来确定被 转运的物质的百分比，并且将其表示为平均数(N=O t3BSA-AleXaASS用作对照。
【具体实施方式】
[0041] 如本领域技术人员将理解的，以上说明详细描述了本发明的某些优选实施例，并 且因此仅仅是代表性的而并不描绘本发明的实际范围。还应当理解的是，在此所使用的术 语用于以下目的：仅仅描述具体实施例并且不是旨在限制由所附权利要求书所限定的本发 明的范围。
[0042] 除非另有定义，在此使用的所有技术和科学术语具有由本发明所属的本领域技术 人员所通常理解的含义。如在此使用的，以下术语具有归于它们的含义，除非另外说明。 [0043 ]作为本发明的基础的研究涉及Cho I i X衍生的多肽序列作为转运蛋白结构域的用 途，该转运蛋白结构域被用来制备分离的递送构建体以增强生物活性治疗剂的肠递送。重 要的是，在此所述的这些系统和方法提供了以下各项：在没有注射的情况下递送大分子剂 量的能力；将"负荷"递送至其中需要它们的活性的细胞内区室中的能力；以及基于纳米颗 粒和树枝状化合物的载体穿过生物膜的递送，要不然该递送会由于大多数这种膜的屏障特 性而将会受到阻碍。
[0044] 成熟Cholix毒素（"Cholix"）是一种由霍乱弧菌分泌的极其活化的单体蛋白质(分 子量70kD)，并且该蛋白质是由三个显著的球形结构域（Ia、II、以及III)、以及一个连接结 构域II和III的小的亚结构域（Ib)组成。成熟Cholix的氨基酸序列由约根森(Jorgensen, R.)等人，《生物化学杂志》(J Biol Chem，283(16): 10671-10678(2008))以及在此引证的参 考文献提供。在本发明的分离的递送构建体的制备中使用的Cholix衍生的多肽序列将衍生 自报道的成熟Cholix的具有634个氨基酸的蛋白质序列。
[0045] 因此，本发明的递送构建体包括一个转运蛋白结构域。如在此使用的"转运蛋白结 构域"是指能够执行某些功能（例如，细胞识别（即，包含一个受体结合结构域）以及转胞吞 作用（即，包含一个转胞吞结构域））的结构域。通常，在本发明的递送构建体的制备中使用 的转运蛋白结构域是Cholix衍生的多肽序列，这些多肽序列具有相应于Cholix的功能结构 域(例如Ia和II)的结构域。
[0046] 除了相应于Cholix功能结构域的分子部分外，本发明的递送构建体可以进一步包 括一种用于递送至受试者的生物区室的大分子。在某些实施例中，该大分子是选自下组，该 组由以下各项组成:核酸、肽、多肽、蛋白质、多糖、以及脂质。在另外的实施例中，多肽是选 自下组，该组由以下各项组成：多肽激素、细胞因子、趋化因子、生长因子、以及凝血因子，它 们通常通过注射而被给予至受试者。所有这些大分子的序列对于本领域的技术人员是熟知 的，并且这些大分子到递送构建体的附着完全处于使用标准技术的本领域的技术人员的技 能之内。
[0047] 大分子可以被引入到不破坏细胞结合或转胞吞活性的递送构建体的任何部分中。 大分子经由可裂解接头而连接至递送载体的剩余部分。"接头"是指共价地亦或通过离子、 范德华力或氢键将两个另外的分子连接的分子，例如在5 '端与一个互补序列杂交并且在3 ' 端与另一个互补序列杂交的一种核酸分子，由此将两个非互补序列连接。"可裂解接头"是 指这样一种接头，该接头可以被降解或以其他方式切断以将两个由可裂解接头连接的组分 分开。可裂解接头通常是通过酶裂解的，这些酶典型地为肽酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶，等 等。在穿过极化上皮膜的递送构建体的转胞吞作用之后，可裂解接头也可以通过环境线索 (例如像，在温度、PH、盐浓度、等等方面的改变)而被裂解（当在环境方面有这样一种改变 时）。
[0048] 在某些实施例中，递送构建体进一步包括第二大分子以及第二可裂解接头，该第 二大分子选自下组，该组由以下各项组成:核酸、肽、多肽、蛋白质、脂质、以及小有机分子， 其中在所述第二可裂解接头处的裂解将所述第二大分子从所述构建体的剩余部分分开。在 某些实施例中，该第一大分子是第一多肽并且所述第二大分子是第二多肽。在某些实施例 中，该第一多肽与第二多肽结合以形成一种多聚体。在某些实施例中，该多聚体是一种二聚 体、四聚体、或八聚体。在另外的实施例中，该二聚体是一种抗体。
[0049] 在某些实施例中，可以将该大分子选择为不可被存在于上皮细胞的基侧膜处的酶 裂解。例如，在这些实例中所述的测定可以用于常规地测试这样一种裂解酶是否能够将有 待递送的大分子裂解。如果是这样的话，常规地可以改变该大分子以消除由该裂解酶识别 的不想要的氨基酸序列。然后可以使用本领域中的常规方法来测试该改变的大分子以确保 它保留了活性。
[0050] 在某些实施例中，该第一和/或