8000巧 m/min、4°C 离屯、5min。重复 2次。
[00巧](5)弃上清，加入1.5mL预冷的0 . lmol/LCaC12溶液，含有15%的甘油，轻轻悬浮菌 体，然后10化L分装到1.5mL离屯、管中，-70°C冰箱保藏备用。
[0030] 3、醋酶基因的克隆
[0031] (1)引物设计
[0032] 分析Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350的全基因组DNA，与NCBI数据库中 已知的约氏乳酸杆菌醋酶对比，设计引物序列为：
[0033] 引物1:5'GGATCCGTGATTCTTATTGATCATCAAACC 3'
[0034] 引物2:5'TCTAGATTATAAATGCTTATCGAACCAGG 3'
[0035] (2)PCR 扩增
[0036] 用 W上合成的两条引物，^Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350的基因组 DM为模板进行PCR扩增。
[0037] 本步骤中扩增体系为： PrirneSTA民HS DNA Polymerase (2.55υ/'μυ ().5'liL 1 OxPrime STAR Buffer lO.uL dNTP Mixl:ure(2.5mM each) 4'liL
[003引模板 DNA lyL 引物 1 (20μΜ) IliL 引物 2(20μΜ) pL (Id化Ο 补足到5(VL
[0039] 扩增程序为：
[0040] 94°Ca〇min
[0041 ] 94°C，30sec; 55°C，30sec;72°C Imin反应30个循环
[0042] 72°Ca〇min
[0043] PCR产物送华大基因测序后得到该醋酶的基因序列，如SEQ ID N0:1所示。根据该 基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0044] (3)双酶切和连接
[0045] 将pCold-II质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10Xcut buffer3yl，DNA 4μ 1，酶Bam Η I和Xba I各0.扣1，无菌水化1共30μΚ37Γ水浴中切Ih。将DNA片段克隆到 pCold-II Vector上，并转化到E.coli DH5a感受态细胞中。连接体系：l〇XDNA ligase buffer 2.5μ1，0ΝΑ片段祉 1，载体DNA 2μ1，Τ40ΝΑ ligase 化 1，无菌水 11.5μ1 共25μΚ16Γ 水浴下连接12h-16h。
[0046] (4)转化
[0047] 步骤；
[004引1在连接体系中加入10化1 D册α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。
[0049] 2放入预热的42°C水浴中，放置90s进行热休克处理。
[00加]3立即冰浴2min。
[0化1] 4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37Γ培养化使菌复苏。
[0052] 5均匀的涂布在含抗生素的LB培养基上。
[0053] 6培养2地长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组 质粒导入化21大肠杆菌感受态中，保存备用。
[0054] 实施例2
[0055]本实施例为本发明所述醋酶的诱导表达及分离纯化。
[0化6] 1、加 500μ1重组菌（BL21大肠杆菌）液到50ml摇瓶。37Γ培养2.化，15Γ下静置 0.5h。再加 20μ1 IPTG，15°C下冷诱导培养2地。发酵得到发酵液离屯、得到菌体，憐酸氨二钢- 憐酸二氨钢缓冲溶液(20mmol/L，pH7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离屯、收集上清得到粗 酶液。
[0057] 2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行儀柱纯化， 洗脱方法为:将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行 排气。然后设置system flow lml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset Al，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之 后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液， 用500mM的高浓度咪挫缓冲液B1梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来，收 集有酶活的洗脱液用超滤管(30-kDa)进行浓缩，得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备 用。
[0化引实施例3
[0059] 本实施例为本发明所述醋酶的最适溫度及溫度稳定性。如表1所示，W阿魏酸甲醋 为底物，将底物与抑为6.0的憐酸缓冲液在25-60°C不同的溫度条件下水浴化测定醋酶的酶 活，确定酶的最适反应溫度为30°C。将本发明所述的醋酶置于30、40、50、与60°(：下处理1小 时，发现30和40°C条件下酶活基本没有损失，当溫度达到50°C时，1小时后剩余酶活为开始 时的40%，溫度高于60°C后，酶于2小时后完全失活。
[0060] 表1溫度对醋酶酶活的影响
[0061]
[0062] 实施例4
[0063] 本实施例为本发明所述醋酶的最适pH值及pH稳定性。如表2所示，W阿魏酸甲醋为 底物，将底物在抑3-9,35°C水浴4h测定醋酶的酶活，结果发现在pH 8条件下测得的醋酶酶 活最高。W阿魏酸甲醋为底物研究pH对本发明所述醋酶稳定性的影响，将醋酶分别置于pH 值为3-9的缓冲液中处理1小时测定剩余酶活发现pH值在7-卵寸酶活比较稳定，pH低于即寸剩 余酶活不足起始的10 %。
[0064] 表2为pH对醋酶酶活的影响
[00 化]
[0066] 实施例5
[0067] 本实施例为不同金属离子对醋酶酶活的影响。将实施例中纯化得到的酶置于浓度 为ImM的不同金属离子的2ml溶液中30分钟后测定其剩余酶活发现Fe2%化2+、加 2+和M+作用 化后，酶活损失较大，化、K+、Na+、Mn2+、Mg2+、Co+促进酶活上升。结果如表3所示。
[006引表3金属离子对酶活性的影响
[0069]
[0070]
[0071 ] 实施例6
[0072] 本实施例为醋酶与不同底物的反应特性，列于表4中。由表4可W看出，该醋酶具有 广泛的底物，对于芳香族醋类表现出了很强的活力，属于阿魏酸醋酶。
[0073] 表4醋酶对不同底物的活性
[0074]
[0075]
[0076] 实施例7
[0077] 本实施例为醋酶水解去淀粉教皮产阿魏酸的应用。200g教皮，加入纯化并冷冻干 燥后的醋酶40mg，加水1000ml，抑自然，40°C保溫12小时，测定得阿魏酸的释放率为72.4%。
【主权项】
1. 一种来源于解淀粉芽孢杆菌的酯酶，其特征在于:所述酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2所示。2. 根据权利要求1所述的酯酶，其特征在于该酯酶对应的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1所 不。3. 根据权利要求1所述的酯酶，其最适反应温度为30°C，最适反应pH为8。4. 根据权利要求1所述的酯酶，其最适底物特征性质表明该酯酶属于阿魏酸酯酶。
【专利摘要】本发明涉及获得的一种酯酶基因及其克隆表达与应用，属于生物工程领域。公开了其底物特性。该酯酶具有广泛的作用，具有重要的工业应用价值。
【IPC分类】C12N15/55, C12N9/18
【公开号】CN105586326
【申请号】CN201610158987
【发明人】蔡宇杰, 王小梅, 陈佳君, 白亚军, 郑晓晖
【申请人】江南大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年3月17日