导培养基含有:1XMS盐、1XB5维生素、30g蔗糖、0.5mg 2，4_D、0.5mgIAA、0.6g MES、0.3mg N6-异戊烯基腺嘌呤、2.5g植物凝胶，pH值为5.8。
[0074](4)基因枪轰击:待愈伤组织形成后，选取表面光滑，圆形粒状，淡黄色的愈伤组织在无菌的滤纸上密集摆放成直径为1.5cm圆形，放入培养皿中，在超净工作台上进行基因枪轰击。基因枪轰击参数设置:金粉直径Ιμπι、真空度28英寸汞柱、压力为900ps1、轰击距离为9cm，金粉不包裹质粒。
[0075](5)农杆菌侵染:将含有pS0Y19质粒的农杆菌LBA4404活化后过夜培养至OD600 =1.0，离心重悬于侵染培养基中，调节OD6(K) = 0.6。挑取轰击过的愈伤组织，立即取出放入含有农杆菌LBA4404的侵染培养基中，并放在摇床上缓慢荡30分钟后，用100W超声波处理2秒。
[0076]其中，侵染培养基成分为:1/10XMS盐、1XB5维生素、3%蔗糖、2.8mg/L FeSO4.7H20、3.8mg/L Na2_EDTA、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、0.02%Silwet L_77、0.3mg/LIAA，pH 值为 5.4。
[0077](6)侵染后的培养:将侵染过的大豆愈伤组织在滤纸上沥干，然后继续在侵染培养基中振荡暗培养3天，振荡速度60r/min，温度25°C。
[0078](7)除菌培养基清洗及继续培养:用除菌培养基一清洗愈伤组织3-5遍，并放入装有除菌培养基一的锥形瓶中振荡I小时。用无菌滤纸吸干菌液，转接到除菌培养基二中，培养一周，转速为60r/min，光周期16h/天，温度25°C。
[0079]除菌培养基一:每升除菌培养基一含有I XMS盐(除去硝酸盐)、0.8g NH4NO3^3.03gKNO3、I XB5维生素、30g蔗糖、0.66g天门冬酰胺、5mg 2,4-D、200mg头孢霉素、50mg特美汀和50mg万古霉素，卩田直为5.7。
[0080]除菌培养基二:每升除菌培养基二含有IXMS盐(除去硝酸盐)、0.8g NH4NO3^3.03gKNO3、I XB5维生素、30g蔗糖、0.66g天门冬酰胺、5mg 2,4-D、10mg头孢霉素、200mg特美汀和50mg万古霉素，pH值为5.7。
[0081](8)筛选及分化:将愈伤组织转接到筛选和分化培养基，每隔2周换一次培养基，光照16h/天，25 °C直至胚状体的形成。
[0082]其中，每升筛选和分化培养基含有:I\1^盐、1\85维生素、6(^麦芽糖七活性炭、30mg草甘膦、1001^头孢霉素、2001^特美汀、501^万古霉素和38植物凝胶，？!1值为5.7。
[0083](9)生根培养:将分化形成的大豆胚状体转移到生根培养基中，光照16h/天，25°C。
[0084]其中，每升生根培养基含有:IXMS盐、I X B5维生素、8mg草甘膦、20g蔗糖、3g植物凝胶，pH 5.8。
[0085](10)炼苗及移栽:将已经生根的植株炼苗3-5天，然后洗去根上残留的凝胶，转移到灭菌过的蛭石:珍珠岩(3:1)中，蛭石要时刻保持湿润状态，光照16h/天，250C。待植株高度约为60cm左右时，光照变为12h/天，甚至更短，以促进其开花。
[0086]结果表明，不经基因枪轰击，超声波和表面活性剂si Iwet L-77处理，农杆菌几乎不能感染愈伤组织，得不到抗性植株。经过基因枪轰击，超声波和表面活性剂silwet L-77处理，能够形成大量的再生转化株。
[0087]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1.一种植物愈伤组织遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)诱导产生植物愈伤组织； 2)利用基因枪轰击步骤I)中的愈伤组织产生所述微创伤口； 3)利用农杆菌在含有表面活性剂的侵染培养基中对步骤2)中的愈伤组织进行侵染，并利用超声波进行处理； 4)对侵染后的愈伤组织进行筛选分化和继代培养。2.如权利要求1所述的植物愈伤组织遗传转化方法，其特征在于，所述基因枪轰击的参数为:金粉直径为1.Ομπι、真空度为28英寸汞柱、压力为900psi以及轰击距离为9cm，金粉不包裹质粒。3.如权利要求1所述的植物愈伤组织遗传转化方法，其特征在于，所述表面活性剂为Silwet L-77，其浓度为0.01-0.03%。4.如权利要求1所述的植物愈伤组织遗传转化方法，其特征在于，所述超声波处理的功率为60-240W，超声处理时间为1-3秒。5.如权利要求1所述的植物愈伤组织遗传转化方法，其特征在于，所述植物为大豆，所述步骤I)包括，将大豆种子消毒及萌发，将萌发后的下胚轴从中间剖开，随后诱导产生愈伤组织。6.如权利要求1所述的植物愈伤组织遗传转化方法，其特征在于，所述步骤3)中的侵染为在所述侵染培养基中振荡培养20-40分钟，所述农杆菌选自EHAl 05、EHAl 01或LBA4404。7.如权利要求1所述的植物愈伤组织遗传转化方法，其特征在于，所述步骤4)包括:先将侵染后的愈伤组织暗培养3天，在第一除菌培养基中清洗侵染后的愈伤组织3-5次，并在所述第一除菌培养基中培养1-2小时；随后在第二除菌培养基中振荡培养6-8天，转速为60r/min，光周期16h/天，温度25°C ;之后在筛选和分化培养基中进行筛选和分化，光照16h/天，温度25°C，每隔两周更换一次培养基。8.如权利要求7所述的植物愈伤组织遗传转化方法，其特征在于: 所述侵染培养基为:1/10XMS盐、B5维生素、3%蔗糖、2.8mg/L FeSO4.7H20、3.8mg/LNa2-EDTA、3.9g/L MES、0.04g/L 乙酰丁 香酮、0.02% Silwet L-77 和 0.3mg/L IAA，pH 值为5.4； 所述第一除菌培养基为:除去硝酸盐的MS盐、1mM NH4NO3、30mM KNO3、B5维生素、3%蔗糖、5mM天门冬酰胺、5mg/L 2，4-D、200mg//L头孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L万古霉素，pH值为5.7; 所述第二除菌培养基为:除去硝酸盐的MS盐、1mM NH4NO3、30mM KNO3、B5维生素、3%蔗糖、5mM天门冬酰胺、5mg/L 2，4-D、100mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀和50mg/L万古霉素，pH值为5.7; 所述筛选和分化培养基为:MS盐、B5维生素、6 %的麦芽糖、0.5 %活性炭、13mg/L筛选剂、100mg/L头孢霉素、200mg/L特美汀、50mg/L万古霉素和0.3 %植物凝胶，pH值为5.7。9.一种组织培养方法，其特征在于，包括如权利要求1所述的植物愈伤组织遗传转化方法，还包括步骤:将筛选分化后的愈伤组织进行生根、炼苗和移栽，培养成再生植株。10.如权利要求9所述的组织培养方法，其特征在于，将生根的植株炼苗3-5天，然后转移到灭菌过的蛭石+珍珠岩中，蛭石保持湿润状态，光照15-17h/天，温度23-27 V，待植株高 度约为50-70cm左右时，光照变为10-13h/天，以促进其开花。
【专利摘要】本发明公开了一种植物愈伤组织遗传转化方法，包括：1)诱导产生植物愈伤组织；2)利用基因枪轰击上述愈伤组织产生所述微创伤口；3)利用农杆菌在含有表面活性剂的侵染培养基中对上述愈伤组织进行侵染，并利用超声波进行处理；4)对侵染后的愈伤组织进行筛选分化和继代培养。还公开了一种组织培养的方法，包括上述植物愈伤组织遗传转化方法，还包括将筛选分化后的愈伤组织进行生根、炼苗和移栽，培养成再生植株。本发明的方法，极大地提高了植物愈伤组织的遗传转化效率、减少嵌合体的发生，转化后代外源基因稳定遗传，对愈伤组织的破坏小，再生植株比例高，在植物育种或筛选中都有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12N15/84, A01H4/00, A01H5/10, C12N15/87
【公开号】CN105713923
【申请号】CN201610141710
【发明人】王彪, 姚陆铭, 卢欣欣, 武天龙
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年3月14日