专利名称：近红外体内荧光纳米粒探针及其制备方法
技术领域：
本发明涉及近红外活体成像领域，具体涉及一种近红外体内荧光纳米粒探针，同时本发明还提供了一种近红外体内荧光纳米粒探针的制备方法。
背景技术：
近红外成像技术是近年来发展起来的一种新型光谱成像手段。该技术所应用的近红外波段(700-900nm)范围内， 避开了有氧血红蛋白、无氧血红蛋白、水等很多内源性物质的主要吸收区，因而在生物组织中的穿透深度较大(可达IOcm)，并且该波段生物自发荧光也降至最低的程度，成像信号受生物组织本底的影响也比较少。近红外成像技术在位无损连续监测生物组织的潜力在药物研究、肿瘤诊断和治疗等生命科学的前沿领域已开始得到重视。近红外荧光探针的研发是近红外成像技术发展的一个瓶颈问题。目前，适合应用于近红外光区的探针种类还非常有限，主要集中在一些有机荧光染料。但这类有机染料普遍存在激发光谱窄、发射光谱宽以及抗光漂白性差等缺点。最近，近红外荧光量子点如CdHgTe,CdTeSe/CdS引起了人们的极大兴趣和关注。这类无机纳米荧光材料发光覆盖范围广，光谱易于调谐，荧光效率也比较高，作为一种新型的近红外荧光探针，在活体生物成像研究中具有巨大的应用潜力。然而目前，单独的普通近红外量子点在生物相容性、稳定性、毒性方面还有一些问题需要克服。为了改善普通量子点的稳定性和毒性的问题，通常采用的方式是对量子点进行表面修饰，制备功能化量子点或者将其包入高分子微球中，但这些方法往往会降低量子点的荧光强度或者体内稳定性，有些高分子微球由于体积过大并不适用于体内成像，并且它们还会需要用到一些昂贵的试剂或者很苛刻的反应条件。因此，亟待开发一种新的具有很好的生物相容性、稳定性、毒性低的修饰方法对单独的量子点进行包裹，以实现其在体内、夕卜成像上有更好的应用。
发明内容
本发明解决的技术问题是克服了现有技术中单独的近红外量子点在稳定性、生物相容性方面的不足，提供一种近红外体内荧光纳米粒探针。为实现上述目的，本发明的近红外体内荧光纳米粒探针，包括水溶性近红外CdHgTe荧光量子点和其外面包裹的脂质体磷脂膜。同时，本发明提供了一种近红外体内荧光纳米粒探针的制备方法，该方法包括如下步骤步骤一，合成水溶性近红外CdHgTe荧光量子点；步骤二，制备脂质体磷脂膜；步骤三，将步骤一合成的水溶性近红外CdHgTe荧光量子点的水溶液加入到步骤二制备的脂质体磷脂膜中进行水合，得到近红外体内荧光纳米粒探针，即近红外CdHgTe量子点-脂质体荧光探针。作为对上述方式的限定，步骤一水溶性近红外CdHgTe荧光量子点的过程是将NaHTe溶液、Cd (NO3) 2溶液和硝酸汞溶液在巯基乙酸(MPA)的作用下，按照Cd2+ NaHTe MPA的摩尔比为I : O. 5 : 2. 4进行反应得到。作为对上述方式的进一步限定，所述的NaHTe溶液是通过如下方法制备得到的将碲粉和NaBH4按照3 2的质量比例，在N2气保护下加入蒸馏水，在35_45°C水浴中进行反应，得到NaHTe溶液。作为对上述方式的更进一步限定，所述的步骤二是将卵磷脂、胆固醇和PEG-6000溶于氯仿得到混合溶液，将该溶液减压浓缩后，得到脂质体磷脂膜。作为对上述方式的更进一步限定，所述减压浓缩是在恒温条件下进行。·此外，作为对上述方式的限定，步骤三将水溶性近红外CdHgTe荧光量子点与脂质体磷脂膜的水合过程为将水溶性近红外CdHgTe荧光量子点的水溶液加入到脂质体磷脂膜内，振摇洗膜；待形成的脂质体薄膜水合变成乳状脂质体混悬液后，在冰浴条件下进行超声分散，得到近红外体内荧光纳米粒探针。本发明的主要贡献在于荧光探针制备的思路，本发明所用的试剂及工艺设备均为现有技术中所常用的，并不是本发明的关键，因此简略描述。本发明的有益效果如下该方法首先合成水溶性近红外CdHgTe荧光量子点，然后将其包裹于自制的脂质体水腔中，经过冰冻超声，得到光谱性能稳定、生物相容性良好的近红外活体荧光探针。其制备过程简单，低成本，使用方便，体内成像效果良好。
下面结合附图及具体实施方式
对本发明做更进一步详细说明图I为近红外CdHgTe量子点-脂质体荧光探针的荧光光谱图。图2为近红外CdHgTe量子点-脂质体荧光探针透射电镜图。图3为单独的CdHgTe量子点和近红外CdHgTe量子点-脂质体荧光探针的抗光漂白实验结果图。图4为三种不同浓度的单独的CdHgTe量子点和近红外CdHgTe量子点-脂质体荧光探针的细胞活力实验结果图。可见在三种不同浓度下本发明所制备的荧光探针的细胞毒性均显著低于单独的CdHgTe量子点。图5为近红外CdHgTe量子点-脂质体荧光探针在小鼠体内的活体成像图。
具体实施例方式下面对实施例中使用的原料来源及仪器型号进行说明Cd(NO3)2 ·2. 5H20、碲粉、二甲基亚砜(DMSO)、NaBH4 购于上海试剂公司。PEG-6000、巯基乙酸(MPA)，购于上海凌峰试剂公司。蛋黄卵磷脂(lipoid，德国)购自上海太伟药业，胆固醇、氯仿，购自江苏永华精细化学品有限公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司。所有细胞培养试剂均购于美国Gibico。图I、图3所用的光谱仪为RF-5301型荧光分光光度计，日本Shimadzu公司。
图2所用的透射电镜为JEM-2100型电子显微镜，日本电子株式会社。图4所用的酶联仪为1500型酶联免疫分析仪,美国Thermo Electron公司。图5所用的近红外成像系统中激光器为HLU32F400808nm，德国Limo公司。本发明所用的试剂及工艺设备均为现有技术中所常用的，并不是本发明的关键，因此简略描述。实施例一步骤一水溶性近红外CdHgTe荧光量子点的制备精密称取碲粉60mg，NaBH440mg,置于25ml的三颈瓶中，在N2气保护下加入二次蒸馏水2ml，40°C水浴中反应30min后，得到紫红色NaHTe溶液。向该溶液中通入N2气30min 将该溶液脱氧。另配制IOOml含92. 4mgCd (NO3)2的溶液，并加入63 μ I巯基乙酸(MPA)为稳定剂，用lmol/L NaOH调pH至11. 2，向其中加入10 μ I硝酸汞溶液。向该溶液中通入N2气30min将该溶液脱氧。在剧烈的搅拌下，注入上述已脱氧的O. 5mol/L NaHTe溶液600 μ 1，使Cd2+ NaHTe MPA的摩尔比为I : O. 5 : 2. 4，然后迅速加热回流至沸腾。回流I小时，得到CdHgTe溶液。步骤二 脂质体磷脂膜的制备将卵磷脂25mg、胆固醇3mg、PEG-600040mg溶于5ml氯仿中得到溶液，转移上述5mL的氯仿溶液到500mL茄形瓶中，恒温水浴37°C，在旋转蒸发仪上旋转蒸发15分钟，除去有机溶剂，使其在烧瓶壁上形成均匀类脂薄膜。步骤三CdHgTe量子点-脂质体突光探针的制备向烧瓶中通入N2进行除氧5min，待溶剂完全除去，加入2mL上述步骤一制备的CdHgTe溶液，用力振摇洗膜。待形成的类脂薄膜水合变成乳状脂质体混悬液后，冰浴超声将该混悬液分散，即得近红外CdHgTe量子点-脂质体荧光探针。将本步骤得到的近红外CdHgTe量子点-脂质体荧光探针进行荧光光谱分析，用荧光分光光度计进行光谱扫描，结果见图I ;稀释后滴加到担载碳膜的400目铜网上，干燥后用透射电镜观察，结果见图2。实施例二(I) CdHgTe量子点和CdHgTe量子点-脂质体荧光探针的稳定性考察取实施例一中制备的CdHgTe量子点和CdHgTe量子点-脂质体荧光探针均置于20W254nm紫外灯下照射，并在0、2、4、6、8、IOh时测定荧光强度，比较两者的抗光漂白能力。结果见图3。可见CdHgTe量子点-脂质体荧光探针的光稳定性明显优于单独的CdHgTe量子点。(2) CdHgTe量子点和CdHgTe量子点-脂质体荧光探针的毒性考察选取人乳腺癌细胞MCF-7细胞，加入96孔培养板内，设五复孔，置37°C，5% CO2孵箱内过夜培养，将培养液更换为O. 5%血清的M199培养液使细胞同步化，然后加入高中低三种浓度的实施例I中所制备的CdHgTe量子点和CdHgTe量子点-脂质体，37°C孵育24h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20 μ 1，继续培养4h，直接弃去全部上清液。加入DMSOlOOy I/孔，微型振荡器上振动5min，使结晶完全溶解，酶联490nm波长处测定吸光度值。结果见图4。可见在不同浓度下CdHgTe量子点-脂质体荧光探针的细胞活力均显著高于单独的CdHgTe量子点，即本发明所制备的CdHgTe量子点-脂质体细胞毒性远小于单独CdHgTe量子点。
(3)近红外CdHgTe量子点-脂质体荧光探针的活体成像取实施例I中得到的近红外CdHgTe量子点-脂质体溶液以5 μ g/g尾静脉注射于经似25脱毛的小鼠体内(昆明鼠)，结果见图5。如图中所示，在近红外成像系统下，CdHgTe量子点-脂质体荧光纳米粒进入小鼠体内可以呈现荧光。在注入小鼠体内IOmin后,拍摄所得图中可见肝脏部位显现出极强荧光信号。·
权利要求
1.一种近红外体内荧光纳米粒探针，其特征在于其包括水溶性近红外CdHgTe荧光量子点和其外面包裹的脂质体磷脂膜。
2.—种近红外体内荧光纳米粒探针的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 步骤一，合成水溶性近红外CdHgTe荧光量子点； 步骤二，制备脂质体磷脂膜； 步骤三，将步骤一合成的水溶性近红外CdHgTe荧光量子点的水溶液加入到步骤二制备的脂质体磷脂膜中进行水合，得到近红外体内荧光纳米粒探针。
3.根据权利要求2所述的近红外体内荧光纳米粒探针的制备方法，其特征在于步骤一水溶性近红外CdHgTe荧光量子点的过程是将NaHTe溶液、Cd (NO3) 2溶液和硝酸汞溶液在巯基乙酸(MPA)的作用下，按照Cd2+ NaHTe MPA的摩尔比为I : O. 5 : 2. 4进行反应得到。
4.根据权利要求3所述的近红外体内荧光纳米粒探针的制备方法，其特征在于所述的NaHTe溶液是通过如下方法制备得到的将碲粉和NaBH4按照3 2的质量比例，在N2气保护下加入蒸馏水，在35-45°C水浴中进行反应，得到NaHTe溶液。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的近红外体内荧光纳米粒探针的制备方法，其特征在于所述的步骤二是将卵磷脂、胆固醇和PEG-6000溶于氯仿得到混合溶液，将该溶液减压浓缩后，得到脂质体磷脂膜。
6.根据权利要求5所述的近红外体内荧光纳米粒探针的制备方法，其特征在于所述减压浓缩是在恒温条件下进行。
7.根据权利要求2所述的近红外体内荧光纳米粒探针的制备方法，其特征在于，步骤三将水溶性近红外CdHgTe荧光量子点与脂质体磷脂膜的水合过程为将水溶性近红外CdHgTe荧光量子点的水溶液加入到脂质体磷脂膜内，振摇洗膜；待形成的脂质体薄膜水合变成乳状脂质体混悬液后，在冰浴条件下进行超声分散，得到近红外体内荧光纳米粒探针。
全文摘要
本发明涉及一种近红外体内荧光纳米粒探针，其包括水溶性近红外CdHgTe荧光量子点和其外面包裹的脂质体磷脂膜。同时本发明还提供了一种近红外体内荧光纳米粒探针的制备方法，其包括步骤一，合成水溶性近红外CdHgTe荧光量子点；步骤二，制备脂质体磷脂膜；步骤三，用步骤一合成的近红外荧光量子点CdHgTe溶液加入到步骤二制备的脂质体磷脂膜中进行水合，得到近红外体内荧光纳米粒探针。本发明提供的探针具有良好的稳定性、生物相容性；制备过程简单，低成本，使用方便，体内成像效果良好。
文档编号C09K11/02GK102876328SQ201210407299
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者胡育筑, 叶超, 李臣贵 申请人:中国药科大学