唑菌酯的荧光标记方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种唑菌酯的荧光标记方法及其应用。提出了一种步骤简单、快速、高效的农药唑菌酯荧光标记的方法，即在催化剂的作用下将唑菌酯用乙二胺进行酰胺化，得到的唑菌酯衍生物在氢氧化银的辅助下进一步同丹磺酰氯酰胺化引入荧光基团，经丹磺酰氯标记的唑菌酯具有明显的荧光特性，采用荧光共聚焦显微镜技术可确定荧光标记唑菌酯在生物体内的移动部位，进而可通过丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的行踪来追踪确定其代谢途径。
【专利说明】唑菌酯的荧光标记方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种对唑菌酯实施荧光标记的方法及其应用，以用于唑菌酯代谢途径 的检测。
【背景技术】
[0002] 唑菌酯是一种甲氧基丙烯酸酯类高效低毒杀菌剂，具有广谱的杀菌活性，以唑菌 酯为主要活性组分的农药具有非常广泛的使用范围，可有效防治黄瓜霜霉病、小麦白粉病， 对油菜菌核病菌、葡萄白腐病菌、苹果轮纹病菌、苹果斑点落叶病菌等也具有良好的抑菌活 性。
[0003] 但迄今为止，唑菌酯及其以唑菌酯为主要活性组分的农药还没有获得农业部的农 药登记许可证书，更不能在国外直接销售，一个主要原因是没有进行完整的药理实验和环 境转移实验，也就是完整的农药安全性评价。
[0004] 放射性同位素标记是药物代谢研究经常采用的一种方法，该技术灵敏度高、易于 代谢产物的跟踪，但衰变很快的放射性元素通常不易引入唑菌酯中，再有放射性活度对生 物体的作用达到一定剂量时，会改变机体的生理状态，产生辐射效应，还存在半衰期短、费 用高、检测时间长、特异性差，操作危险、不能反映药物分子在代谢过程中发生的结构变化 等缺点。有专利提出在唑菌酯标记方面，采用 14c进行标记的《杀菌剂唑菌酯14c标记化合 物的合成方法》，申请号：201010558062. 6。由于14C半衰期较长，利用其放射性（活度）进 行检测时，存在灵敏度低的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是为解决现有技术的不足，提出一种步骤简单、快速、高效的农药唑菌 酯荧光标记的方法。可实现对唑菌酯代谢途径的研究，在高灵敏度条件下进行检测分析与 追踪。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：在催化剂的作用下将唑菌酯用 乙二胺进行酰胺化，得到的唑菌酯衍生物在氢氧化银的辅助下进一步同丹磺酰氯酰胺化引 入荧光基团。
[0007] 所述的将唑菌酯用乙二胺进行酰胺化，是将唑菌酯溶解于甲醇中并以氧化钙作为 催化剂，按摩尔比1:3至1:10加入乙二胺，在40°C?45°C温度下充分反应后过滤、蒸干反 应液，用二氯甲烷：甲醇=40 :1洗脱液进行柱层析纯化，得到唑菌酯衍生物。
[0008] 所述的用丹磺酰氯酰胺化引入荧光基团，是将所述的唑菌酯衍生物和丹磺酰氯按 摩尔比1:1. 05至1:1. 15加入到二氯甲烷中，并加入催化剂4-二甲氨基吡啶（DMAP)、缚酸 剂三乙胺和氢氧化银，室温下完全反应，过滤后，用二氯甲烷：甲醇=40 :1洗脱液进行柱层 析纯化，得到丹磺酰氯荧光标记的唑菌酯，收率为93%，总收率为79%。
[0009] 本发明方法制备的丹磺酰氯荧光标记的唑菌酯特别适用于农药的安全性检测，即 采用荧光共聚焦显微镜技术可确定荧光标记唑菌酯在生物体内的移动部位，进而可通过丹 磺酰氯荧光标记唑菌酯的行踪来追踪确定其代谢途径。
[0010] 本发明唑菌酯的荧光标记方法，较同位素标记方法具有步骤简单、快速、高效的优 点。丹磺酰氯作为荧光衍生试剂与含有伯胺官能团化合物进行键合标记，具有简便、快速、 灵敏、稳定等特点，经丹磺酰氯标记的唑菌酯还具有不影响其杀虫效果的特点，其杀菌活性 对黄瓜黑星病菌的EC50值与唑菌酯106mg/L的EC50值相近似，离体杀菌活性达到80%以 上。所制得的丹磺酰氯荧光标记的唑菌酯作用于hela细胞时，观察其荧光信号，可追踪其 移动部位，标记效果好、安全可靠，通过荧光标记唑菌酯的行踪，可更加有效地追踪其代谢 途径。本发明将在农药唑菌酯代谢过程的研究中发挥重要作用，实际应用价值高。
[0011] 荧光标记法在生命科学、现代分子生物学及药物学等领域得到广泛应用，具有操 作简便、高灵敏度、重现性好等特点。以丹磺酰氯为标记物的技术途径通常是要求底物上含 有胺基或需要在底物上引入胺基，再通过酰胺化引入发光基团。采用常规有机合成方法， 通过酯的胺解反应，在唑菌酯上引入胺基的效率较低，通常收率只有?50% ;通过酰胺引入 发光基团，因形成的形成盐酸三甲胺，受平衡影响导致目标产物收率低，通常只有?65%左 右。因此，采用常规的有机合成途径两步总收率仅为30%，进而造成唑菌酯与荧光标记物的 巨大浪费。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1是唑菌酯全扫描质谱谱图；
[0013] 图2是唑菌酯[Μ+ΗΓ413. 2二级串联质谱谱图；
[0014] 图3是唑菌酯衍生物质谱谱图；
[0015] 图4是丹磺酰氯突光标记唑菌酯的质谱谱图；
[0016] 图5是丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的核磁谱图GHNMR谱图溶剂d6-DMS0);
[0017] 图6是唑菌酯及其衍生物和荧光标记物的紫外谱图；
[0018] 图7是丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的高效液相色谱谱图；
[0019] 图8是丹磺酰氯荧光标记唑菌酯表面增强拉曼光谱；
[0020] 图9是丹磺酰氯荧光标记唑菌酯在hela细胞内的共聚焦显微镜成像照片。
【具体实施方式】
[0021] 通过以下实施例对本发明作进一步详细说明.
[0022] 实施例1
[0023] 丹磺酰氯荧光标记的唑菌酯的制备。
[0024] a.将唑菌酯用乙二胺进行酰胺化：
[0025] 称取412mg(lmmol)唑菌酯，加入10mL甲醇，加入经500°C焙烧的固体碱氧化钙 200mg，滴加0. 67mL (?lOmmol)乙二胺，缓慢升温至4(TC后反应6小时。过滤后，蒸干反应 液，制备色谱柱层析纯化（洗脱液组成二氯甲烷：甲醇=20:1)得374mg (0. 85mmol)唑菌酯 衍生物，收率为85% ;化学反应式如下：
[0026]
【权利要求】
1. 一种唑菌酯的荧光标记方法，其特征在于，包括如下步骤：将唑菌酯用乙二胺进行 酰胺化，得到的唑菌酯衍生物进一步用丹磺酰氯酰胺化引入荧光基团。
2. 根据权利要求1所述的唑菌酯的荧光标记方法，其特征在于，所述的将唑菌酯用乙 二胺进行酰胺化，是将唑菌酯溶解于甲醇中并以氧化钙作为催化剂，按摩尔比1:3至1:10 加入乙二胺，在40°C?45°C温度下充分反应后过滤、蒸干反应液，用二氯甲烷：甲醇=40 :1 洗脱液进行柱层析纯化，得到唑菌酯衍生物。
3. 根据权利要求1所述的唑菌酯的荧光标记方法，其特征在于，所述的用丹磺酰氯酰 胺化引入荧光基团，是将所述的唑菌酯衍生物和丹磺酰氯按摩尔比1:1. 05至1:1. 15加入 到二氯甲烷中，并加入催化剂4-二甲氨基吡啶、缚酸剂三乙胺和氢氧化银，室温下完全反 应，过滤后，用二氯甲烷：甲醇=40 :1洗脱液进行柱层析纯化，得到丹磺酰氯荧光标记的唑 菌酯。
4. 用权利要求1所述方法所获得的丹磺酰氯荧光标记唑菌酯在农药的安全性检测中 的应用，采用荧光共聚焦显微镜技术可确定荧光标记唑菌酯在生物体内的移动部位，进而 可通过丹磺酰氯荧光标记唑菌酯的行踪来追踪确定其代谢途径。
【文档编号】C09K11/06GK104193682SQ201410348233
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】石磊, 李 杰, 程舸, 刘晓梅 申请人:吉林大学