一种上转换纳米粒子的制备及其用于显现潜血指纹的方法与流程

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种上转换纳米粒子的制备及其用于显现潜血指纹的方法。

背景技术：

指纹是一个最有用的类型的实物证据，因为他们代表着每个人手指独特的脊皮肤，具体是指人体手部皮肤表面的乳突花纹,是典型的遗传性状。纹作为一种物证被誉为“证据之首”已为举世所公认，广泛应用于查缉案件、认证罪犯。如何在犯罪现场种类繁多的客体上发现、显现和收集它，是指纹利用的关键问题。到目前为止，已经有很多方法被开发来提高潜在汗液指纹。然而，谋杀的犯罪现场还会留下沾有血迹的指纹，这通常是很有价值的犯罪的证据。血液在沉积指纹表面用肉眼很容易识别，因为红色的血液和背景之间的颜色对比是显而易见的。然而，有时分析脊细节需要额外的高度识别。物质表面反复触碰或水与血液混合犯罪的时候，血指纹红颜色褪色成为肉眼难以识别的潜在血指纹。因此，形象化的血指纹具有重大的意义。

稀土上转换发光纳米材料是一类掺杂稀土元素，在近红外光激发下发出可见光的荧光材料。光学稳定性好，材料无毒性，长时间在强光或激发光照射下发光稳定，无闪烁，不易光解和光漂白，激发光源为980nm的近红外，避免生物组分自发荧光和散射光干扰，可用做生物标记材料，将上转换纳米离子与抗人体血红蛋白连接，发明一种兼具荧光性和特异性的NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb纳米粒子。针对人血红蛋白，与动物血红蛋白没有交叉。可以作为显现试剂显现潜血指纹，材料合成方法简单且显现过程快。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种单分散棒状结构NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb上转换纳米粒子的制备方法及其在潜血指纹显现中的应用，使用该方法制备的单分散棒状结构NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb纳米粒子分散性好、特异性强、荧光强度高，可显现玻璃、硅片、不锈钢、铝箔、唱片和瓷砖表面潜在血指纹。溶液润湿在潜指纹的血液上而显出纹线，多余的溶液被移液枪吸走，用去离子水轻轻冲洗，可观察到清晰的指纹纹路。在980nm激光光源照射下，可观察到发光的指纹纹路。

本发明单分散棒状结构NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb上转换纳米粒子的制备方法包括如下步骤：

配制溶液：室温条件下，0.30～0.35g NaCl溶解在二次去离子水中，在强烈搅拌下缓慢加入5mL油酸和5mL乙醇，继续搅拌30min，使其混合均匀，依次加入0.027～0.028g YbCl₃，0.024～0.025g YCl₃，0.074～0.075g GdCl₃，0.0030～0.0035g ErCl₃，最后逐滴加入1mL 0.2mol/L的NH₄F溶液。搅拌均匀，转移到20mL反高压釜，密封，在160℃高压灭菌器中加热6-10h，自然冷却至室温。将获得的溶液离心分离，用二次去离子水和乙醇交替洗涤多次，加入5ml0.2mol/L的CTAB溶液，搅拌均匀，加热至32℃，加热30min，再升温至68℃，加热25min，降温至30℃，用二次去离子水离心洗涤数次，即得棒状NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺纳米粒子(如图1所示)。离心分离去除上清夜后，溶解在氯仿中，与15～20g质量分数为1％的Poly(acrylic acid)-乙醇溶液在搅拌下反应10h，用乙醇离心洗涤数次，所得固体溶解在二次去离子水中，加入200μL的EDC(1mol/L)溶液和200μL的NHS(1mol/L)溶液，磁力轻搅拌30min，加入10～20μL的Mouse Anti-hHb(H5A3)(0.1mg/mL)，轻搅拌12h，二次去离子水离心洗涤溶解，得6mg/mL的NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb棒状纳米粒子溶液。

通过透射电镜表征，上转换纳米粒子的形貌为棒状纳米颗粒，且连接anti-hHb后不改变纳米粒子的形貌。测试NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb的荧光光谱，在980nm的激发波长条件激发，发出绿色的荧光(如图2所示)。

NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb的制备方法的应用，NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb用于显现潜血指纹的方法，具体过程如下：

制备血液潜指纹样品：用移液枪取少量血液样品，均匀涂抹在手指上，将手指轻轻按在玻璃、硅片、不锈钢、铝箔、唱片、瓷砖等任一指纹载体表面，表面会留下潜在的血指纹印迹，得到血液潜指纹样品；潜血指纹的显现：取少量上转换纳米粒子溶液迅速滴在血液潜指纹样品的表面，NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb上转换纳米粒子与血指纹成分中的血红蛋白特异性结合，在指纹纹线区域聚集较多，形成纹线区域的集中聚集，吹风机吹干，待样品上的液体都烘干后，指纹载体在980nm的激发光源下发出绿色的荧光，指纹样品的指纹纹线清晰地呈现出来(如图3所示)，从而达到荧光显现潜血指纹的目的，此时，可拍照进行留取指纹数据。

本发明的有益效果为：

1、本发明采用连有抗人体血红蛋白的上转换纳米粒子，有效识别人的血液并使潜血指纹显色速度更快，具有更好的敏感性和特异性。

2、不破坏潜指纹的潜在信息，不影响潜指纹的DNA鉴定。

3、合成、检测过程无任何毒副作用。

附图说明

图1、NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/anti-hHb纳米粒子的透射电镜图；

图2、NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/anti-hHb纳米粒子的荧光光谱。

图3、NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/anti-hHb溶液显现潜血指纹。

具体实施方式

下面结合附图进一步说明本发明。

一种上转换纳米粒子的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)上转换纳米粒子溶液的制备：NaCl溶解在二次去离子水中，在强烈搅拌下缓慢加入体积比为1:1的油酸和乙醇，继续搅拌30min，使其混合均匀，依次加入YbCl₃，YCl₃，GdCl₃，ErCl₃，最后逐滴加入的NH₄F溶液，搅拌均匀，转移到高压釜，密封，在170-200℃高压灭菌器中加热8-10h，自然冷却至室温；

(2)制NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺纳米粒子：将获得的溶液离心分离，用二次去离子水和乙醇交替洗涤多次，加入的CTAB溶液，搅拌均匀，加热至30-35℃，加热30-50min，再升温至65-75℃，加热25-50min，降温至30-25℃，用二次去离子水离心洗涤数次，即得棒状NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺纳米粒子；

(3)离心分离去除上清夜后，溶解在氯仿中，与质量分数为1％的聚丙烯酸-乙醇溶液在搅拌下反应10h，用乙醇离心洗涤数次；

(4)将步骤(3)所得固体溶解在二次去离子水中，加入体积比为1:1的浓度为1mol/L的EDC溶液和NHS溶液，磁力轻搅拌30min，加入Mouse Anti-hHb(H5A3)，轻搅拌12h，用BSA封闭，二次去离子水离心洗涤溶解，得的对人血特异性识别的NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb棒状纳米粒子溶液。

实施例1

室温条件下，0.30～0.35g NaCl溶解在二次去离子水中，在强烈搅拌下缓慢加入5mL油酸和5mL乙醇，继续搅拌30min，使其混合均匀，依次加入0.027～0.028g YbCl₃，0.024～0.025g YCl₃，0.074～0.075g GdCl₃，0.0030～0.0035g ErCl₃，最后逐滴加入1mL 0.2mol/L的NH₄F溶液。搅拌均匀，转移到20mL反高压釜，密封，在160℃高压灭菌器中加热10h，自然冷却至室温。将获得的溶液离心分离，用二次去离子水和乙醇交替洗涤多次，加入5ml 0.2mol/L的CTAB溶液，搅拌均匀，加热至32℃，加热30min，再升温至68℃，加热25min，降温至30℃，用二次去离子水离心洗涤数次，即得棒状NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺纳米粒子。离心分离去除上清夜后，溶解在氯仿中，与15.34g质量分数为1％的Poly(acrylic acid)-乙醇溶液在搅拌下反应10h，用乙醇离心洗涤数次，所得固体溶解在二次去离子水中，加入200μL的EDC(1mol/L)溶液和200μL的NHS(1mol/L)溶液，磁力轻搅拌30min，加入20μL的Mouse Anti-hHb(H5A3)(0.1mg/mL)，轻搅拌12h，二次去离子水离心洗涤溶解，得6mg/mL的NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb棒状纳米粒子。如图图1所示，通过透射电镜表征，上转换纳米粒子的形貌为棒状纳米颗粒，且连接anti-hHb后不改变纳米粒子的形貌。测试NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb的荧光光谱，在980nm的激发波长条件激发，发出绿色的荧光(如图2所示)。

实施例2

室温条件下，0.30～0.35g NaCl溶解在二次去离子水中，在强烈搅拌下缓慢加入5mL油酸和5mL乙醇，继续搅拌30min，使其混合均匀，依次加入0.027～0.028g YbCl₃，0.024～0.025g YCl₃，0.074～0.075g GdCl₃，0.0030～0.0035g ErCl₃，最后逐滴加入1mL 0.2mol/L的NH₄F溶液。搅拌均匀，转移到20mL反高压釜，密封，在200℃高压灭菌器中加热6h，自然冷却至室温。将获得的溶液离心分离，用二次去离子水和乙醇交替洗涤多次，加入5ml 0.2mol/L的CTAB溶液，搅拌均匀，加热至32℃，加热30min，再升温至68℃，加热25min，降温至30℃，用二次去离子水离心洗涤数次，即得棒状NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺纳米粒子。离心分离去除上清夜后，溶解在氯仿中，与15.34g质量分数为1％的Poly(acrylic acid)-乙醇溶液在搅拌下反应10h，用乙醇离心洗涤数次，所得固体溶解在二次去离子水中，加入200μL的EDC(1mol/L)溶液和200μL的NHS(1mol/L)溶液，磁力轻搅拌30min，加入20μL的Mouse Anti-hHb(H5A3)(0.1mg/mL)，轻搅拌12h，二次去离子水离心洗涤溶解，得6mg/mL的NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb棒状纳米粒子。如图1所示，通过透射电镜表征，上转换纳米粒子的形貌为棒状纳米颗粒，且连接anti-hHb后不改变纳米粒子的形貌。测试NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb的荧光光谱，在980nm的激发波长条件激发，发出绿色的荧光(如图2所示)。

实施例3

室温条件下，0.30～0.35g NaCl溶解在二次去离子水中，在强烈搅拌下缓慢加入5mL油酸和5mL乙醇，继续搅拌30min，使其混合均匀，依次加入0.027～0.028g YbCl₃，0.024～0.025g YCl₃，0.074～0.075g GdCl₃，0.0030～0.0035g ErCl₃，最后逐滴加入1mL 0.2mol/L的NH₄F溶液。搅拌均匀，转移到20mL反高压釜，密封，在180℃高压灭菌器中加热8h，自然冷却至室温。将获得的溶液离心分离，用二次去离子水和乙醇交替洗涤多次，加入5ml 0.2mol/L的CTAB溶液，搅拌均匀，加热至32℃，加热30min，再升温至68℃，加热25min，降温至30℃，用二次去离子水离心洗涤数次，即得棒状NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺纳米粒子。离心分离去除上清夜后，溶解在氯仿中，与15.34g质量分数为1％的Poly(acrylic acid)-乙醇溶液在搅拌下反应10h，用乙醇离心洗涤数次，所得固体溶解在二次去离子水中，加入200μL的EDC(1mol/L)溶液和200μL的NHS(1mol/L)溶液，磁力轻搅拌30min，加入20μL的Mouse Anti-hHb(H5A3)(0.1mg/mL)，轻搅拌12h，二次去离子水离心洗涤溶解，得6mg/mL的NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb棒状纳米粒子。如图图1所示，通过透射电镜表征，上转换纳米粒子的形貌为棒状纳米颗粒，且连接anti-hHb后不改变纳米粒子的形貌。测试NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb的荧光光谱，在980nm的激发波长条件激发，发出绿色的荧光(如图2所示)。

实施例4

制备血液潜指纹样品：用移液枪取少量血液样品，均匀涂抹在手指上，将手指轻轻按在硅片(Silicon chip)指纹载体表面，表面会留下潜在的血指纹印迹，得到血液潜指纹样品；

潜血指纹的显现：取少量上转换纳米粒子溶液滴在血液潜指纹样品的表面，NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb上转换纳米粒子与血指纹成分中的血红蛋白特异性结合，在指纹纹线区域聚集较多，形成纹线区域的集中聚集，吹风机吹干，待样品上的液体都吹干后，指纹载体在980nm的激发光源下发出绿色的荧光，指纹样品的指纹纹线清晰地呈现出来，从而达到荧光显现潜指纹的目的，此时，可拍照进行留取指纹数据(如图3所示)。

实施例5

制备血液潜指纹样品：用移液枪取少量血液样品，均匀涂抹在手指上，将手指轻轻按在玻璃(Glass)指纹载体表面，表面会留下潜在的血指纹印迹，得到血液潜指纹样品；

潜血指纹的显现：取少量上转换纳米粒子溶液滴在血液潜指纹样品的表面，NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺/Gd³⁺/COOH/anti-hHb上转换纳米粒子与血指纹成分中的血红蛋白特异性结合，在指纹纹线区域聚集较多，形成纹线区域的集中聚集，用二次去离子水轻轻冲洗多余的溶液，吹风机吹干，待样品上的液体都吹干后，指纹载体在980nm的激发光源下发出绿色的荧光，指纹样品的指纹纹线清晰地呈现出来，从而达到荧光显现潜指纹的目的，此时，可拍照进行留取指纹数据(如图3所示)。

如图3所示，在实施例4和实施例5的操作方法基础上，通过上转换纳米粒子溶液依次清晰地呈现出以下指纹载体的血液潜指纹样品，指纹载体依次为：光盘(Compact dise)铝合金箔(Aluminum foil)、不锈钢薄板(Stainless steel sheet)、瓷砖(Ceramic tile)。

以上所述并非是对本发明的限制，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实质范围的前提下，还可以做出若干变化、改型、添加或替换，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。