t ,J = 5.4Hz , 2H), 3.93(t ,J = 5.4Hz , 2H), 3.78(t,J = 4.5Hz,2H) ,3.66(t,J = 4.5Hz,2H),3.54(t,J = 4.7Hz,2H),3.39(t,J = 4.7Hz, 2H),3.30(q ,J = 7.0Hz,2H),1.02(t ,J = 7.0Hz,3H).
[0059] 实施例3、荧光探针Nap-AD的制备
[0060] 步骤a):在惰性气氛下，将5.OOg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到IOOmL无水乙二醇 单甲醚中，再注入1.47g 3，6,9_三氧杂-1-氨基癸烧，回流反应6小时。反应完全后，放置过 夜有针状结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亚胺3.60g(产率为95% )。
[0061] 步骤b):在惰性气氛下，将5. OOg N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亚胺和 〇. 76g水合肼，加入到IOOmL DMF中回流反应1小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析分 离纯化得到最后产物Nap-AD 4.30g(产率为97%)，黄色固体。
[0062] 1H 匪R(400MHz，Chloroform-d)S8 · 07(t，J = 8 · 3Hz，2H)，7 · 74(d，J = 8 · 3Hz，1H)， 7.29- 7. ll(m,2H) ,6.93(d ,J = 8.5Hz , 1H) ,4.34( t ,J = 5.4Hz , 2H), 3.93(t ,J = 5.4Hz , 2H), 3.78(t,J = 4.5Hz,2H) ,3.66(t,J = 4.5Hz,2H),3.54(t,J = 4.7Hz,2H),3.39(t,J = 4.7Hz, 2H),3.30(q ,J = 7.0Hz,2H),1.02(t ,J = 7.0Hz,3H).
[0063] 实施例4、荧光探针Nap-AD的制备
[0064] 步骤a):在惰性气氛下，将5.OOg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到IOOmL无水丙醇中， 再注入0.98g 3，6，9-三氧杂-1 -氨基癸烷，回流反应15小时。反应完全后，放置过夜有针状 结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亚胺 2.40g(产率为 95%)。
[0065] 步骤b):在惰性气氛下，将5. OOg N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亚胺和 〇.51g水合肼，加入到IOOmL DMSO中回流反应5小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析 分离纯化得到最后产物Nap-AD 4.00g(产率为91%)，黄色固体。
[0066] 1H 匪R(400MHz，Chloroform-d)S8 · 07(t，J = 8 · 3Hz，2H)，7 · 74(d，J = 8 · 3Hz，1H)， 7.29- 7. ll(m,2H) ,6.93(d ,J = 8.5Hz , 1H) ,4.34( t ,J = 5.4Hz , 2H), 3.93(t ,J = 5.4Hz , 2H), 3.78(t,J = 4.5Hz,2H) ,3.66(t,J = 4.5Hz,2H),3.54(t,J = 4.7Hz,2H),3.39(t,J = 4.7Hz, 2H),3.30(q ,J = 7.0Hz,2H),1.02(t ,J = 7.0Hz,3H).
[0067] 实施例5、荧光探针Nap-Ad的制备
[0068] 步骤a):在惰性气氛下，将5.OOg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到IOOmL无水正丁醇 中，再注入〇.59g 3,6,9_三氧杂-1-氨基癸烷，回流反应13小时。反应完全后，放置过夜有针 状结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亚 胺1.40g(产率为94%)。
[0069] 步骤b):在惰性气氛下，将5. OOg N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亚胺和 0.38g水合肼，加入到IOOmL丙酮中回流反应17小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析 分离纯化得到最后产物Nap-AD 3.90g(产率为88%)，黄色固体。
[0070] 1H 匪R(400MHz，Chloroform-d)S8 · 07(t，J = 8 · 3Hz，2H)，7 · 74(d，J = 8 · 3Hz，1H)， 7.29- 7. ll(m,2H) ,6.93(d ,J = 8.5Hz , 1H) ,4.34( t ,J = 5.4Hz , 2H), 3.93(t ,J = 5.4Hz , 2H), 3.78(t,J = 4.5Hz,2H) ,3.66(t,J = 4.5Hz,2H),3.54(t,J = 4.7Hz,2H),3.39(t,J = 4.7Hz, 2H),3.30(q ,J = 7.0Hz,2H),1.02(t ,J = 7.0Hz,3H).
[0071] 实施例6、式(I)所示化合物的光谱性质
[0072] 称取3.7mg Nap-AD，溶于IOmL DMS0,配成母液（ImM),即得到Nap-AD试剂盒。将100 yL的此母液滴加到不同浓度甲醛的磷酸盐缓冲液中，并用相应的磷酸盐缓冲液定容到 10mL。测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以450nm进行激发，发射峰的强度为I535 ; 激发和发射的狭缝宽度分别为1.5/3。
[0073]图2为Nap-AD试剂盒对不同甲醛水溶液的荧光响应图。由图2可知，随着甲醛浓度 的增加，波长为535nm处的发射峰的荧光强度逐渐增大，证明本发明试剂盒对甲醛具有灵敏 的响应。
[0074]图3为Nap-AD试剂盒在波长535nm下的荧光发射强度I535与甲醛浓度关系曲线。由 图3可知，随着水溶液中甲醛浓度的增加，荧光发射值I535逐渐增大。在甲醛浓度为0~ImM的 范围内，发射峰的荧光强度值I 535与水溶液中甲醛的浓度呈良好的线性关系(R2 = O.99)。证 明本发明试剂盒可以对甲醛进行准确测量。
[0075] 图4为Nap-AD试剂盒对常见共存离子或生物小分子的荧光响应图。由图4可知，常 见共存阳离子、阴离子、生物小分子的加入并不能使溶液的荧光发射值I 535发生改变。证明 本发明试剂盒对甲醛具有优秀的选择性。
[0076] 实施例7、细胞内甲醛含量的测定
[0077] 1)在37度和5% (v/v)C02条件下，用含有10% (v/v)FBS(胎牛血清）、lOOU/mL盘尼 西林、100yg/mL的链霉素的DMEM培养基培养HeLa细胞。细胞使用前用PBS缓冲液清洗。
[0078] 2)在HeLa细胞中加入PBS(pH 7.4)，再加入Nap-AD(IyM)孵育30min，用PBS洗三遍 后，进行共聚焦荧光成像，其中激发波长为450nm，收集波段为450-600nm。然后，向上述HeLa 细胞中再加入甲醛（1〇μΜ)的磷酸缓冲盐溶液，继续孵育30min后，在激光共聚焦显微镜上进 行成像，其中激发波长为450nm，收集波段为450-600nm〇
[0079]由图5可知，载有Nap-AD的细胞在未加甲醛之前无荧光，表明Nap-AD可以很好地透 过细胞膜。而当加入甲醛以后，细胞呈现黄色荧光发射，表明Nap-AD可以在细胞内与甲醛发 生特异性响应。证明本发明试剂盒可以在细胞中对甲醛进行检测。
[0080]最后应说明的是，上述实施例仅举出以Nap-AD化合物为荧光试剂，其余荧光试剂 由于结构与性质相近，其浓度、实验激发波段选择不一一列出，然而其并非用于限定本发 明。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，应当可以作出各种修 改和变更。
【主权项】
1. 一种检测甲醒的巧光探针，其特征在于:该巧光探针的化学式为式(I)，式(I)中，η为0~5的整数，R为甲基，或乙基，或丙基，或正下基。2. 根据权利要求1所述的一种检测甲醒的巧光探针，其特征在于:其结构式如式(II)，3. 权利要求1或2所述的一种检测甲醒的巧光探针的制备方法，包括如下步骤： 步骤(1)式（III)所示4-漠-1,8-糞二甲酸酢与氨基化合物在醇中反应得到式(IV)所示 取代的4-漠-1,8-糞酷亚胺；式(IV)中，η为0~5的整数，R为甲基，或乙基，或丙基，或正下基； 步骤(2)在惰性气氛下，在水合阱的存在下，式(IV)所示化合物在有机溶剂中反应即得 式(I)所示化合物。4. 根据权利要求3所述的一种检测甲醒的巧光探针的制备方法，其特征在于： 步骤（1)中所述式（III)所示4-漠-1，8-糞二甲酸酢和所述氨基化合物的摩尔比可为1 ~5:1; 所述醇为甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正下醇或乙二醇单甲酸； 所述反应溫度可为50~120度;反应时间为1~20小时。5. 根据权利要求3所述的一种检测甲醒的巧光探针的制备方法，其特征在于： 步骤(2)中所述碱与式(IV)所示4-漠-1,8-糞酷亚胺与水合阱的摩尔比可为1~0.1:1; 所述反应溫度可为0~100度;反应时间可为1~20小时； 所述反应溶剂在有机溶剂中进行； 所述有机溶剂可为乙腊、N，N-二甲基甲酯胺、二甲基亚讽、丙酬中至少一种。6. -种检测甲醒的试剂盒，包括式(I)所示化合物和溶剂； 式(I)所示化合物的浓度为0.00 ImM~lOOmM; 所述溶剂为水、乙醇、二甲基亚讽中任一种。7. -种甲醒含量的检测方法，包括如下步骤： (1) 向不同浓度甲醒的缓冲盐中加入相同浓度的式（I)所示化合物，配置至少3种不同 甲醒含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液； 所示缓冲溶液可W是憐酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、肥PES缓冲溶液、棚酸-棚酸 钢缓冲溶液中的任何一种； 所示标准溶液的pH值为5~11; 所示标准溶液中式(I)所示化合物的浓度为InM~ΙμΜ; 所示标准溶液中甲醒的含量为0.1 nM~ImM; (2) 分别测定所述标准溶液的巧光发射光谱，激发波长为450nm，W甲醒浓度为横坐标， W 1535为纵坐标，建立标准曲线； 1535表示所述标准溶液在波长为535nm处的巧光发射峰强度值； (3) 向待测样品中加入式（I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式（I)所示化 合物的浓度相等;测定其在激发波长为450nm的激发光下的巧光发射谱，即可根据标准曲线 计算得出待测样品的甲醒含量。
【专利摘要】本发明公开了一种检测甲醛的荧光探针及其制备方法与应用。本发明提供的用于检测甲醛的荧光探针的结构如式I所示。本发明同时提供了式I所示化合物的制备方法。本发明提供的用于检测甲醛的试剂盒，包括式I所示化合物和溶剂。本发明提供的萘酰亚胺类染料的“关-开”型甲醛探针及其专用检测试剂盒对甲醛溶液具有良好的响应，能够实现对细胞内甲醛的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
【IPC分类】C07D221/14, C09K11/06, G01N21/64
【公开号】CN105542756
【申请号】CN201610077333
【发明人】韩益丰, 陈波, 魏婷
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月3日