一种检测甲醛的荧光探针及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物与环境检测技术领域，具体涉及一种作为甲醛荧光探针材料使用 的萘酰亚胺-肼衍生物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 甲醛(HCHO)是一种重要的化工原料和有机溶剂，被广泛的用于防腐和消毒，并常 用于树脂、塑料、橡胶、染料等制造业。甲醛(HCHO)具有刺激性臭味，能强烈刺激呼吸道和消 化道，毒性较大。此外，长期吸入甲醛将引发鼻癌、消化道癌、肺癌、脑癌、白血病和老年痴呆 症等疾病（参见R. G · Liteplo，R. Beauchamp，M. E .Meek, R. Chenier ,Formaldehyde (Concise International Chemical Assessment Documents),World Health Organization: GeneVa，2002)。因此，有效地检测或监控生物样品或环境样品中的甲醛一直是相关领域的 研究热点。
[0003] 荧光检测法由于其优秀的检测灵敏度和选择性，并能实现对生物样品的实时、在 线检测而受到研究者的广泛关注。萘酰亚胺类荧光分子因其具有良好的光稳定性、高摩尔 消光系数和量子产率等独特优点而成为该方法最重要的荧光母体之一，在多种待测分子的 荧光检测中得到了广泛的应用。
[0004] 目前仅有2篇文献报道了可用于甲醛检测的小分子荧光探针，他们均是基于氮杂 Cope重排反应而设计的（参见A· Roth，H. Li，C.Anorma，and J· Chan，A Reaction-Based Fluorescent Probe for Imaging of Formaldehyde in Living Cells,J.Am.Chem.Soc., 2015,137,10890-10893以及T.F.Brewer and C.J.Chang，An Aza-Cope Reactivity-Based Fluorescent Probe for Imaging Formaldehyde in Living Cells,J.Am.Chem.Soc., 2015,137,10886-10889)。当存在甲醛的条件下，探针分子中的活性基团与甲醛发生氮杂 Cope重排反应，导致探针分子的荧光性质发生变化，从而实现对甲醛的特异性设别。
[0005] 然而，这两种报道的甲醛探针存在分子结构复杂，合成步骤冗长，所用试剂昂贵， 反应速度缓慢等缺点，不利于其在复杂的生物体内或是环境中进行检测。因此亟须一种新 颖的、具有良好生物稳定性的、结构复杂、合成简单的且能实现快速响应检测的甲醛荧光探 针。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明旨在提供一种来自萘酰亚胺和肼的用于 检测甲醛的荧光探针及其制备方法和应用。
[0007] 本发明的核心在于利用4-肼基-1，8-萘酰亚胺构筑经典的ICT体系。当存在甲醛的 条件下，肼基与甲醛发生缩合反应生成腙，进而使得原有PET效应消失而产生荧光，通过上 述方案，获得荧光"关-开"型的荧光响应，大大提高了检测的灵敏度。
[0008] 首先，为了达到上述目的，本发明提供了一种如式（I)所示的萘酰亚胺-对叠氮苄
[0009] 式（I)中，η为0~5的整数，R为甲基，或乙基，或丙基，或正丁基。
[0010] 式(I)所示化合物具体可为式(II)所示化合物(Nap-AD)。
[0012] 如图1所示，上述探针的制备方法包括下列步骤：
[0013] (1)式(III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐与氨基化合物在醇中反应得到式(IV)所示 取代的4-溴-1，8-萘酰亚胺。
[0015] 式（IV)中，η为0~5的整数，R为甲基，或乙基，或丙基，或正丁基。
[0016] (2)在惰性气氛下，在水合肼的存在下，式(IV)所示化合物在有机溶剂中反应即得 式(I)所示化合物。
[0017] 上述制备方法，步骤(1)中所述氨基化合物具体可为3，6，9-三氧杂-1-氨基癸烷。
[0018] 式（I II)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨基化合物的摩尔比可为1~5:1，具体 可为1.5:1。
[0019] 所述醇可为甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，乙二醇单甲醚，具体可为乙醇。
[0020] 所述反应温度可为50~120度，具体可为80度;反应时间可为1~20小时，具体可为 5小时。
[0021] 上述制备方法，步骤(2)中所述式(IV)所示4-溴-1，8-萘酰亚胺与水合肼的摩尔比 可为1~0.1:1，具体可为0.5:1。
[0022] 所述反应温度可为0~100度，具体可为80度;反应时间可为1~20小时，具体可为 10小时。
[0023] 所述反应溶剂在有机溶剂中进行;有机溶剂可为乙腈、N，N_二甲基甲酰胺、二甲基 亚砜、丙酮中至少一种，具体可为乙腈。
[0024] 本发明进一步提供了一种检测甲醛的试剂盒，包括式(I)所示化合物和溶剂。
[0025] 式（I)所示化合物的浓度为0.0 OlmM~IOOmM，具体可为ImM。
[0026] 所述溶剂为水、乙醇、二甲基亚砜中任一种。
[0027] 式（I)所示化合物或上述试剂盒可应用于水溶液中甲醛的检测。
[0028] 所述水溶液中甲醛的含量具体可通过以下步骤进行检测：
[0029] (1)向不同浓度甲醛的缓冲盐中加入相同浓度的式（I)所示化合物，配置至少3种 不同甲醛含量的含有式(I)所示化合物的标准溶液。
[0030] 所示缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tr i S-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液、硼酸-硼酸 钠缓冲溶液中的任何一种，具体可以是磷酸盐缓冲溶液；
[0031 ]所示标准溶液的pH值为5~11，具体可以是7.2;
[0032] 所示标准溶液中式（I)所示化合物的浓度为InM~ΙμΜ;
[0033] 所示标准溶液中甲醛的含量为0.1 nM~ImM;
[0034] (2)分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为450nm，以甲醛浓度为横 坐标，以1535为纵坐标，建立标准曲线。
[0035] 1535表不所述标准溶液在波长为535nm处的焚光发射峰强度值；
[0036] (3)向待测样品中加入式（I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式（I)所 示化合物的浓度相等;测定其在激发波长为450nm的激发光下的荧光发射谱，即可根据标准 曲线计算得出待测样品的甲醛含量。
[0037] 上述步骤(2)或步骤(3)中荧光强度可在荧光仪上进行检测。
[0038]本发明具有如下特点：
[0039] 1)本发明提供的荧光探针是黄色固体，分子结构的中聚醚链保证了探针的水溶性 和光学稳定性。
[0040] 2)本发明提供的荧光探针，其溶液对甲醛的浓度敏感，随着甲醛浓度的增加，紫外 灯下可观察到其水溶液的荧光由无变为黄色。
[0041] 3)本发明提供的荧光探针，其发射波长为535nm，为荧光"关-开"型响应，能大大消 除检测时检测条件差异对结果的影响，提高检测的灵敏度。
[0042] 4)本发明提供的荧光探针对甲醛浓度呈线性关系，可以用于甲醛的精确测量。 [0043]本发明提供的萘酰亚胺类染料的"关-开型"甲醛探针及其试剂盒对甲醛溶液具有 良好的响应，能够实现对细胞内甲醛的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广 和应用等优点。
【附图说明】
[0044]图1为实施例1制备的荧光探针Nap-AD的合成路线。
[0045]图2为实施例6制备的Nap-AD试剂盒对不同甲醛水溶液的荧光响应图。
[0046]图3为实施例6制备的Nap-AD试剂盒在波长535nm下的荧光发射强度I535与甲醛浓 度关系曲线。
[0047] 图4为实施例6制备的Nap-AD试剂盒对常见共存离子或生物小分子的荧光响应图。
[0048] 图5为实施例6制备的Nap-AD试剂盒对细胞内甲醛的荧光成像图；其中，（a)为未加 Nap-AD之前的细胞荧光成像图；（b)为加入Nap-AD后的细胞荧光成像图；（c)为加入Nap-AD 和甲醛后细胞荧光成像图。
【具体实施方式】
[0049] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0050] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0051 ] 实施例1、荧光探针Nap-AD的制备
[0052] 步骤a):在惰性气氛下，将5.OOg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到IOOmL无水乙醇中， 再注入2.95g 3，6，9-三氧杂-1-氨基癸烷，回流反应5小时。反应完全后，放置过夜有针状结 晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-3,6,9-三氧杂癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亚胺 6.10g(产率为 80%)。
[0053] 步骤b):在惰性气氛下，将5. OOg N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亚胺和 3.79g水合肼，加入到IOOmL丙酮中回流反应12小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析 分离纯化得到最后产物Nap-AD 4. IOg(产率为93% )，黄色固体。
[0054] 1H MMR(400MHz，Chloroform-d)S8 · 07(t，J = 8 · 3Hz，2H)，7 · 74(d，J = 8 · 3Hz，1H)， 7.29- 7. ll(m,2H) ,6.93(d ,J = 8.5Hz , 1H) ,4.34( t ,J = 5.4Hz , 2H), 3.93(t ,J = 5.4Hz , 2H), 3.78(t,J = 4.5Hz,2H) ,3.66(t,J = 4.5Hz,2H),3.54(t,J = 4.7Hz,2H),3.39(t,J = 4.7Hz, 2H),3.30(q ,J = 7.0Hz,2H),1.02(t ,J = 7.0Hz,3H).
[0055] 实施例2、荧光探针Nap-AD的制备
[0056] 步骤a):在惰性气氛下，将5. OOg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入至IjIOOmL无水甲醇中， 再注入1.96g 3,6,9_三氧杂-1-氨基癸烧，回流反应10小时。反应完全后，放置过夜有针状 结晶析出，过滤，冷乙醇洗涤三次，得到中间体N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亚胺 4.90g(产率为 96%)。
[0057] 步骤b):在惰性气氛下，将5. OOg N-3，6，9-三氧杂癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亚胺和 1.52g水合肼，加入到IOOmL乙腈中回流反应20小时。待反应完全后，旋干反应液，经柱层析 分离纯化得到最后产物Nap-AD 4. IOg(产率为93% )，黄色固体。
[0058] 1H MMR(400MHz，Chloroform-d)S8 · 07(t，J = 8 · 3Hz，2H)，7 · 74(d，J = 8 · 3Hz，1H)， 7.29- 7. ll(m,2H) ,6.93(d ,J = 8.5Hz , 1H) ,4.34(