芽孢杆菌在降解芳香族化合物中的应用的制作方法

本发明涉及一种芽孢杆菌在降解芳香族化合物中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

芳香族化合物是环境中常见的一种污染物，主要来自于农药生产、印染化工、造纸、制药和石油等工农业中发生的事故泄露和产生的副产物释放等过程，以及经过一定生物化学作用后产生的相对简单结构的芳香族化合物存在于环境中。这些分布广泛的芳香族成分，并经过一系列的微生物的氧化还原等作用后使得污染水域内经常检测到芳香酸类的中间代谢物，如苯甲酸，邻、间、对-甲基苯甲酸等。据报道，我国每年进入环境的芳香族化合物有数千种之多，它们多以无色、白色或者浅黄色的低溶解度固体形式存在于环境中，具有高熔点，高沸点和低蒸汽压等特点使其具有长时期难以被降解的特性，且它们会对人类产生急性致癌、致诱变和致畸等危害性。因此，在近二十年里对芳香族化合物污染控制的研究也受到了人们很大程度地关注。

目前处理芳香族污染物常采用的方法是物理法、化学法和生物法。这些处理方法都有各自的优点和缺点，其中物理方法通常包括混凝沉淀、加热法、吸附法、萃取法、洗涤法等，操作起来相对比较简便，更适用于高浓度的苯环化合物工业废水废液以及事故性污染的处理，但该方法的局限性在于面临高能耗的挑战，且只能使污染物发生形态和地点的变化，并不能彻底解决污染问题，因而常作为一种预处理手段，与其他的处理方法联合使用。化学法主要有湿式氧化法、光催化氧化法、超临界水氧化法和声化学氧化法等，化学法通常会造成二次污染，不能彻底解决污染问题。生物降解是一种低成本，高效率，所能处理的环境污染闽值低、残留少，无二次污染，易操作的方法。修复苯环化合物污染的生物主要包括微生物(细菌和真菌)、植物和菌根。应用生物降解原理来处理被污染环境的生物修复技术近年来发展很快，因此筛选高效的苯环化合物降解菌，研究其降解特性并将其应用于污染治理中具有重要的实际意义。

本发明采用的一株芽孢杆菌L1，能够高效降解对羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸，3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲醛、邻苯二酚和苯甲酸等环境污染物，是用于芳香族化合物染污治理的有效候选菌株。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供菌株芽孢杆菌L1在降解芳香族化合物一种应用，该方法简单易行。

本发明通过下述技术方案实现：

本发明首先提供一株芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)，于2013年保藏于日本微生物菌种保藏中心，保藏编号为JCMNo.18543，16srDNA序列已提交至NCBI数据库，登陆号为JQ044788。

该菌的筛选分离、鉴定等详细过程描述均已公开，为本领域技术人员公知材料。详见文章：Zhu D ,Tanabe SH ,Xie C ,Honda D ,Sun J , Ai L.Bacillus ligniniphilus sp. nov., an alkaliphilic and halotolerant bacterium isolated from sediments ofthe South China Sea. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. DOI：10.1099/ijs.0.058610-0)。

本发明还提供了芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)在降解芳香族化合物中的应用，所述芳香族化合物包括：对羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸，3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲醛、邻苯二酚和苯甲酸等。

本发明所述芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)的最佳降解温度为27-33℃，最适降解的芳香族化合物的浓度为100-2000mg/L。

所述芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)应用于降解芳香族化合物，按照以下步骤进行：

将含有芳香族化合物的无机盐培养基pH调为7-9，然后将OD₆₀₀值为0.6-0.8的芽孢杆菌L1，按体积比1-3%(V/V)的接种量接种，于温度27-33℃条件下进行反应；所述的含有芳香族化合物的无机盐培养基中的浓度优选为100-2000mg/L；所述反应为振荡反应，振荡速度为100-220rpm；所述反应的时间为60-120h。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)能够降解多种芳香族化合物，且对浓度为500mg/L的对羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲醛、邻苯二酚和苯甲酸降解率均可达90%以上。与现有技术相比，不仅降解效率明显高于现在国内的苯环有机物降解菌，且该菌株的降解谱具有丰富的多样性，适合应用在工业废水及造纸黑夜等环境治理方面，相对于物理化学法成本低，且无二次污染。

附图说明

图1为芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对浓度为500mg/L的对羟基苯甲酸在不同时间的降解效果；其中，a为未接种菌株的对照；b为接种菌株培养12h；c为接种菌株培养24h。

图2为芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对浓度为500mg/L的3,4-二羟基苯甲酸在不同时间的降解效果；其中，a为未接种菌株的对照；b为接种菌株培养12h；c为接种菌株培养24h。

图3为芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对浓度为500mg/L的2,5-二羟基苯甲酸在不同时间的降解效果；其中，a为未接种菌株的对照；b为接种菌株培养12h。

图4为芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对浓度为500mg/L的3-甲氧基-4-羟基苯甲酸在不同时间的降解效果；其中，a为未接种菌株的对照；b为接种菌株培养24h；c为接种菌株培养36h。

图5为芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对浓度为500mg/L的3-甲氧基-4-羟基苯甲醛在不同时间的降解效果；其中，a为未接种菌株的对照；b为接种菌株培养24h；c为接种菌株培养48h，d为接种菌株培养72h。

图6为芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对浓度为500mg/L的邻苯二酚在不同时间的降解效果；其中，a为未接种菌株的对照；b为接种菌株培养24h。

图7为芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对浓度为500mg/L的苯甲酸在不同时间的降解效果；其中，a为未接种菌株的对照；b为接种菌株培养36h；c为接种菌株培养48h。

图8为芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对不同浓度的3,4-二羟基苯甲酸降解效果图。

图9为芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对不同浓度的3-甲氧基-4-羟基苯甲酸降解效果图。

图10为芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对不同浓度的邻苯二酚降解效果图。

图11为芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)在5天内对含多种芳香族化合物的无机盐培养基中的COD浓度影响变化结果。

图12为芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对印染废水中芳香族化合物的降解结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对3,4-二羟基苯甲酸的降解效果

芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)是从中国南海海底泥中分离筛选得到的，其分离筛选和鉴定过程详见文章：(Zhu D ,Tanabe SH ,Xie C ,Honda D ,Sun J , Ai L.Bacillus ligniniphilus sp. nov., an alkaliphilic and halotolerant bacterium isolated from sediments ofthe South China Sea. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. DOI：10.1099/ijs.0.058610-0)。

该菌的筛选分离、鉴定等详细过程描述均已公开，为本领域技术人员公知材料。

本实施例考察了芽孢杆菌L1对不同浓度3,4-二羟基苯甲酸的降解情况，主要步骤如下 ：将细菌在富集培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH值为9培养至对数期，按1%(V/V)的接种量分别接种到灭过菌的初始浓度为 100、500、1000、1500、和 2000mg/L 的3,4-二羟基苯甲酸作为唯一碳源无机盐培养基中，在温度为30℃，转速为200rpm条件下振荡培养。每隔一定的时间检测其中的3,4-二羟基苯甲酸浓度并计算降解率。

3,4-二羟基苯甲酸降解率测定：采用紫外分光光度法测定，如图2为芽孢杆菌对浓度为500mg/L的 3,4-二羟基苯甲酸在不同时间段的降解曲线，图2可见，在285nm处有特征吸收峰，且浓度c与吸光度A呈线性相关，c=325.52A+13.86，以超纯水为对照，将285nm处的吸光度作为3,4-二羟基苯甲酸浓度测定指标：

降解率(%)=(c₀- c_n)/c₀×100%

c₀—接菌前培养基中3,4-二羟基苯甲酸的浓度

c_n—培养一定时间培养基中3,4-二羟基苯甲酸的浓度

结果如图8所示。 在 30℃的条件下，毛单胞菌L1 在 60h 内对初始浓度为 100、500、1000、1500 和 2000mg/L 的3,4-二羟基苯甲酸，降解率分别为 100%，97%，78%，68%，46%。对低浓度的3,4-二羟基苯甲酸（500mg/L以下）基本能降解完全，而对于较高浓度的3,4-二羟基苯甲酸 （2000mg/L）降解率在反应60h后也能达到46%。浓度较高时，降解效率也相对较低，这是由于高浓度底物可能会对菌体生长产生抑制作用。

实施例2：芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1) 对3-甲氧基-4-羟基苯甲酸的降解效果

主要步骤同实施例1，按3%(V/V)的接种量分别接种到灭过菌的初始浓度为 100、500、1000、1500、和 2000mg/L 的3-甲氧基-4-羟基苯甲酸作为唯一碳源无机盐培养基中，在温度为28℃，转速为180rpm条件下振荡培养。如图4为芽孢杆菌对浓度为500mg/L的 3-甲氧基-4-羟基苯甲酸在不同时间段的降解曲线，图4可见，在275nm处有特征吸收峰，且浓度c与吸光度A呈线性相关，c=352.11A+17.43，以超纯水为对照，将275nm处的吸光度作为对羟基苯甲酸浓度测定指标并计算出降解率。

结果如图9所示。 在 28℃的条件下，芽孢杆菌L1 在60h内对初始浓度为 100、500、1000、1500 和 2000mg/L 的3-甲氧基-4-羟基苯甲酸，降解率分别为 100%，98%，70%，68%，45%。对低浓度的3-甲氧基-4-羟基苯甲酸（500mg/L以下）基本能降解完全，而对于较高浓度的3-甲氧基-4-羟基苯甲酸（2000mg/L）降解效果相对较差，且在36h后降解速率明显降低，这可能是因为会产生一些有毒的中间代谢产物对菌体生长会产生抑制作用，细胞进入衰亡期。

实施例3：芽孢杆菌L1 (Bacillus ligniniphilus L1)对邻苯二酚的降解效果

主要步骤同实施例1，按3%(V/V)的接种量分别接种到灭过菌的初始浓度为 100、500、1000、1500、和 2000mg/L 的邻苯二酚作为唯一碳源无机盐培养基中，在温度为32℃，转速为150rpm条件下振荡培养。如图6为芽孢杆菌对浓度为500mg/L的邻苯二酚在不同时间段的降解曲线，图6可见，在273nm处有特征吸收峰，且浓度c与吸光度A呈线性相关，c=490.20A+24.92，以超纯水为对照，将273nm处的吸光度作为邻苯二酚浓度测定指标并计算出降解率。

结果如图10所示。 在32℃的条件下，芽孢杆菌L1 在 60h 内对初始浓度为 100、500、1000、1500 和 2000mg/L 的邻苯二酚，降解率分别为 97%，90%，63%，49%，38%。对低浓度的邻苯二酚（ 100mg/L 以下）基本能降解完，而对于较高浓度的邻苯二酚（2000mg/L）降解效果较差。这是因为一定量的菌体有一个最适底物范围，高底物浓度可能会对菌体生长会产生抑制作用。

操作方法同实施例1、2或3，考察芽孢杆菌L1 对对羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲醛、苯甲酸的降解效果，图1、图3、图5、图7分别为芽孢杆菌L1 对浓度为500mg/L的对羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲醛、苯甲酸在不同时间的降解效果。

图1可见，接种菌株芽孢杆菌L1的12h内对羟基苯甲酸降解较微弱，在24h的时候初始浓度为500mg/L对羟基苯甲酸几乎降解完全。而从图3可以发现芽孢杆菌L1在12h内就将初始浓度为500mg/L 2,5-二羟基苯甲酸几乎降解完全。图5可见，菌株对3-甲氧基-4-羟基苯甲醛降解速率相对缓慢，接菌培养72h的时候才将其降解完全。图7可见，菌株在48h内将苯甲酸初始浓度为500mg/L几乎降解完全。

实施例4：芽孢杆菌L1 (Bacillus ligniniphilus L1)对多种芳香族化合物的降解效果

考察了芽孢杆菌L1 对多种芳香族化合物的降解情况，主要步骤如下 ：将芽孢杆菌在富集培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0-7.2)中培养至对数期，按3%(V/V)的接种量接种到对羟基苯甲酸、2,5-二羟基苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲醛和苯甲酸初始浓度分别为 200、400、500、600和300mg/L 的无机盐培养基中，在温度为30℃，转速为220rpm条件下振荡培养。在该培养基中，4种芳香族化合物贡献了全部的COD（化学需氧量）负荷，且在河流污染和工业废水性质的研究以及废水处理厂的运行管理中，COD是一个重要的而且能较快测定的有机物污染参数,因此可以用COD的去除率表征芳香族化合物降解，每隔一定的时间检测其中的COD浓度并计算降解率。COD的测定采用重铬酸盐法(GB11914-89)。

结果如图11所示。 在 30℃的条件下，芽孢杆菌L1在5天内对上述培养基中的COD浓度变化如图11所示，在前2天COD降解迅速，随后缓慢下降。经过5天的培养，COD浓度从1410 mg/L下降到了886mg/L，降解率达到了37%。

实施例5：芽孢杆菌L1(Bacillus ligniniphilus L1)对印染废水的降解效果

印染废水是我国主要工业废水之一，废水产生量大，并且具有碱性强、色度高、有机物浓度高、成分复杂、生物降解性能差等特点。印染废水中含有大量的多种芳香族化合物，均具有毒性或致癌性，对这些芳香族化合物的去除一直是废水处理中的重点。

本实施例考察了芽孢杆菌L1 对印染废水中芳香族化合物的降解情况，操作方法同实施例4。

将富集培养好的菌株按3%(V/V)的接种量直接接种到COD初始浓度为1200 mg/L的印染废水中，在温度为30℃，转速为200rpm条件下振荡反应，并每隔一定的时间检测其中的COD浓度。

结果如图12所示， 在 30℃的条件下，芽孢杆菌L1在5天内对上述培养基中的COD浓度变化如图12所示，在前2天COD降解缓慢，这是由于印染废水成分复杂，菌株处于适应期，而在第3天的时候降解速率较快，随后缓慢下降。经过5天的培养，COD浓度从1200 mg/L下降到了792mg/L，降解率达到了34%。