专利名称：4－(n，n－二甲氨基)偶氮苯－4’－磺酰氟及其合成方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属标记试剂合成技术领域。具体涉及一种新型标记试剂(NewLabeling Reagent)4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟及其合成和应用。这种标记试剂不仅可用于蛋白质一级结构的测定、进行蛋白质或蛋白质组学研究，还可以用于新药研究开发，用于医疗卫生机构诊断疑难病症、药效评估和作为国家药检单位、质检单位进行质量监控的标准试剂。
背景技术：
目前在蛋白质或蛋白质组学研究领域所用的标记试剂，其中某些产品对于组成人体蛋白质的某些氨基酸例如二级氨基酸、色氨酸、半胱氨酸不能完全适用。此外由于某些产品与氨基酸反应生成的衍生化产物稳定性低、影响后续检测操作正常进行。而某些标记试剂或是对空气中的水分敏感、或是检测灵敏度不够、或是合成工序繁复、或是价格昂贵也显示出若干不足之处。由于在4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟(英文名4-(Dimethylamino)azobenzene-4’-Sulfonylfluoride，简称dabsyl.fluoride，代号SINORO-4D)的分子中同时含有在可见光区或是在近紫外光区可以进行检测的结构和可以与蛋白质、氨基酸或其他具有氨基或羟基的化合物反应的活性基团，从而达到化学衍生化一仪器检测的效果。作为标记试剂化解了现有标记试剂产品的不足之处。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以检测的、仪器响应值高的、合成方便、成本较低的、新型标记试剂4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟(简称dabsyl.fluoride，代号SINORO-4D)。
本发明的另一目的是提供标记试剂dabsyl.fluoride的合成方法及其中间产物对乙酰氨基苯磺酰氟(英文名p-acetamidobenzenesulfonyl fluoride，简称aabsyl.fluoride，代号SINORO-4A)的合成方法。
本发明的又一目的是提供标记试剂dabsyl.fluoride在蛋白质、氨基酸分析中的应用。
本发明的再一目的是提供标记试剂dabsyl.fluoride的中间产物对乙酰氨基苯磺酰氟(aabsyl.fluoride)在蛋白质、氨基酸分析中的应用。
本发明的目的可以通过以下措施来达到本发明所述的4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟，其分子式为(CH3)2C6H4N＝NC6H4SO2F(简称dabsyl.fluoride，代号SINORO-4D)。为红色粉状固体，分子量307.33，熔点151℃。
该化合物可以通过以下连续反应步骤进行合成和应用1)以苯胺为原料在50-60℃间经乙酐乙酰化制得乙酰苯胺；2)乙酰苯胺与氯磺酸在温度不高于60℃的条件下进行氯磺化反应，生成对乙酰氨基苯磺酰氯；3)对乙酰氨基苯磺酰氯与金属氟化物在水溶液中发生氟代反应生成对乙酰氨基苯磺酰氟，其分子式为p-CH3CONHC6H4SO2F(简称aabsyl.fluoride，代号SINORO-4A)。为白色晶状固体，分子量217.22，熔点175.19℃。金属氟化物优选氟化钠或氟化钾；温度在60-110℃，优选为80-90℃。
4)对乙酰氨基苯磺酰氟在强酸中加热回流水解，生成对氨基苯磺酰氟；强酸优选浓盐酸、浓硫酸；5)对氨基苯磺酰氟在盐酸和亚硝酸钠水溶液中，温度低于10℃条件下进行重氮化反应，生成氯化磺酰氟重氮苯；6)氯化磺酰氟重氮苯与N，N-二甲苯胺在低温下、pH 6-9的水溶液中进行偶合反应，得到最终产物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟。反应条件优选为10℃以下、pH 6-8。
将按照上述方法得到的4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟在介质pH为9.3，温度为35℃时，和组成人体蛋白质的20种氨基酸进行衍生化反应30分钟，即可生成用紫外分光光度计在可见光区432-438nm处进行检测的衍生化产物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰-氨基酸(dabsyl-NHCHRCOOH)。检测灵敏度达到pmol级。
上述步骤3)得到的中间体对乙酰氨基苯磺酰氟(分子式p-CH3CONHC6H4SO2F，简称aabsyl.fluoride，代号SINORO-4A)同样是一种很好的标记试剂。在介质pH 9.3，温度35℃时，和组成人体蛋白质的20种氨基酸进行衍生化反应30分钟，即可生成用紫外分光光度计在紫外光区250-255nm处进行检测的衍生化产物对乙酰氨基苯磺酰-氨基酸(aabsyl-NHCHRCOOH)。检测灵敏度达到pmol级。
由本发明方法制备的4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟和对乙酰氨基苯磺酰氟相对于其它标记试剂的优势a)在温和条件下(35℃、pH 9.3、30分钟内)和一级或二级氨基酸进行衍生化反应。以及在适当条件下和一级或二级醇羟基，或酚羟基进行衍生化反应，生成便于检测的衍生化产物。
b)衍生化产物用紫外分光光度计在可见光区或近紫外光区内检测，检测灵敏度达到pmol级。
c)标记试剂稳定，便于纯化和保存。
d)经化学衍生化反应后生成的衍生化产物稳定。故分析结果可靠和重复性好。
e)经化学衍生化反应生成的衍生化产物不会发生消旋作用。有利于结构测定和适合于高活性肽的合成。
f)在标记试剂合成，衍生化反应和衍生化产物分离，检测过程中不需要采用毒性强、价格昂贵试剂或溶剂。
g)合成方便、成本相应较低。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明，但其并不限制本发明的保护范围。
实施例1(1)乙酰化把18.6克苯胺溶于500毫升水和17克浓硫酸配成的溶液中，搅拌加热到50℃。加入25毫升乙酐。当乙酐全溶时，加入浓度为30％的醋酸钠水溶液100毫升，用冰水冷却。过滤析出的白色产物、水洗、在40℃干燥，得产物乙酰苯胺22克，产率81.5％。熔点115℃。
(2)氯磺化在装有搅拌器、温度计和氯化氢气体吸收器的三口瓶中、加入58克氯磺酸，搅拌冷却到15℃以下。加入13.5克乙酰苯胺，加热到60℃，反应2小时。冷却后倒入冰水中，沉淀、过滤、水洗到中性。得产物对乙酰氨基苯磺酰氯19克，产率81％。熔点149℃。
(3)制取对乙酰氨基苯磺酰氟把70克对乙酰氨基苯磺酰氯加入到盛有19克氟化钠溶于400毫升水的三口瓶内。搅拌加热至60-110℃，反应1小时。冷却、过滤，在冰醋酸中重结晶后，得产物对乙酰氨基苯磺酰氟，熔点175-176℃。
(4)水解向上述反应物中加入20％盐酸75毫升，加热回流30分钟，待悬浮物消失后，冷却过滤。用10％的氢氧化钠溶液中和滤液到白色的游离胺析出。过滤、水洗、乙醇重结晶后得31克产物对氨基苯磺酰氟，熔点68-69℃。(3)、(4)两步合并产率为60％。
(5)重氮化把1.4克对氨基苯磺酰氟溶于10毫升水和2毫升浓盐酸中，搅拌下在0-5℃间向对氨基苯磺酰氟盐酸溶液中加入浓度为23％的亚硝酸钠水溶液2.4毫升进行重氮化反应，制得氯化磺酰氟重氮苯。
(6)偶合把上述氯化磺酰氟重氮苯的水溶液在搅拌下加入到冷却到10℃以下的0.97克N，N-二甲苯胺溶于1.5毫升浓盐酸和9毫升水配成的溶液中。用浓度为10％的碳酸钠水溶液调整pH到6-8，得红色沉淀。静置分层，过滤、干燥后得红色粉状固体产物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟2克，产率84％。分子量307.33，熔点151℃。
实施例2将实施例1步骤(3)中的氟化钠改用氟化钾，反应温度控制在80-90℃，其它均与实施例1相同，同样制得产物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟2克，收率83％。
实施例3将实施例1步骤(3)中的氟化钠改用氟化铷，反应温度控制在80-90℃，其它均与实施例1相同，同样制得产物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟2克，收率83％。
实施例4(应用)衍生化反应准确称取20种标准氨基酸溶入100μl浓度为0.1mol/L、pH为9.3的碳酸氢钠缓冲液中(每种氨基酸浓度为3.5nmol)，再加入200μl浓度为4μmol/mL的4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟溶于乙醇中的溶液。在pH 9.3、35℃反应30分钟，即得衍生化产物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰-氨基酸(dabsyl-NHCHRCOOH)。
高效液相色谱分离检测向上述衍生液中加入体积比为1/1的乙醇/磷酸氢二钠(pH7、浓度为50mmol)的反应终止稀释液700μl。离心，取20μl上层清液进样。用含有4％N-二甲基甲酰胺、pH 6.5、浓度为25mM的醋酸钠缓冲液作为洗脱液A，100％的乙醇作为洗脱液B，进行二元梯度洗脱，在可见光区432-438nm处进行检测。灵敏度达到pmol级。
实施例5(应用)衍生化反应取浓度为0.05mol/L的对乙酰氨基苯磺酰氟的乙醇溶液200μL，注入到盛有38μL溶有20种氨基酸的，每种氨基酸浓度为0.002mol/L的硼酸钠缓冲液中，再加入5μL乙醇(甲醇)。在pH 9.3、35℃时反应30分钟，即得衍生化产物对乙酰氨基苯磺酰-氨基酸(aabsyl-NHCHRCOOH)。甲醇和乙醇均可作为衍生化反应的溶剂。对于大多数氨基酸而言，甲醇用量为氨基酸剂量的5-7倍时，达到最高的衍生化产率。
毛细管电泳分离检测采用由20mM的硼酸、140mM的十二烷基硫酸钠和20mM的氯化钠配成的缓冲溶液作为流动相，20种氨基酸的衍生化产物可以在15分钟内得到分离和检测。(其流出顺序为1.赖氨酸，2.谷氨酰胺，3.苯丙氨酸，4.苏氨酸，5.天冬酰胺，6.异亮氨酸，7.亮氨酸，8.吉氨酸，9.丝氨酸，10.蛋氨酸，11.脯氨酸，12.丙氨酸，13.甘氨酸，14.苯丙氨酸，15.色氨酸，16.半胱氨酸，17.对乙酰氨基苯磺酰氟，18.色氨酸，19.天冬氨酸，20精氨酸，21.谷氨酸，22.组氨酸，23.酪氨酸.)检测灵敏度对于大多数氨基酸而言达到0.1-0.4pmol。
采用本发明方法制备的化合物作为标记试剂与现有标记试剂的性能对比参见下表
柱前标记试剂性能比较表
权利要求
1.4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟，分子式为(CH3)2NC6H4N＝NC6H4SO2F。
2.按照权利要求1所述的标记试剂，其特征在于该试剂为红色粉状固体，分子量307.33，熔点151℃。
3.权利要求1所述标记试剂的合成方法，其特征在于通过以下连续反应步骤进行合成1)以苯胺为原料在50-60℃间经乙酐乙酰化制得乙酰苯胺；2)乙酰苯胺与氯磺酸在温度不高于60℃的条件下进行氯磺化反应，生成对乙酰氨基苯磺酰氯；3)对乙酰氨基苯磺酰氯与金属氟化物在60-110℃间的水溶液中反应生成对乙酰氨基苯磺酰氟；4)对乙酰氨基苯磺酰氟在强酸中加热回流水解，生成对氨基苯磺酰氟；5)对氨基苯磺酰氟在盐酸和亚硝酸钠水溶液中，低温10℃下进行重氮化反应，生成氯化磺酰氟重氮苯；6)氯化磺酰氟重氮苯与N，N-二甲苯胺在低温下、pH 6-9的水溶液中进行偶合反应，得到最终产物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟。
4.按照权利要求3的方法，其特征在于步骤3)中金属氟化物为氟化钠或氟化钾。
5.按照权利要求3的方法，其特征在于步骤3)中温度为80-90℃。
6.按照权利要求3的方法，其特征在于步骤4)中强酸为浓盐酸或浓硫酸中的一种或两种。
7.按照权利要求3的方法，其特征在于步骤6)中反应温度为10℃以下、pH为6-8。
8.按照权利要求3所述标记试剂对乙酰氨基苯磺酰氟的合成方法，其特征在于通过以下连续反应步骤进行合成1)以苯胺为原料在50-60℃间经乙酐乙酰化制得乙酰苯胺；2)乙酰苯胺与氯磺酸在温度不高于60℃的条件下进行氯磺化反应，生成对乙酰氨基苯磺酰氯；3)对乙酰氨基苯磺酰氯与金属氟化物在60-110℃水溶液中反应生成对乙酰氨基苯磺酰氟。
9.权利要求1所述标记试剂的用途，其特征在于4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰氟和组成人体蛋白质的20种氨基酸进行衍生化反应，生成用紫外分光光度计在可见光区432-438nm处进行检测的衍生化产物4-(N，N-二甲氨基)偶氮苯-4-磺酰-氨基酸。
10.权利要求8方法制备的标记试剂的用途，其特征在于对乙酰氨基苯磺酰氟与组成人体蛋白质的20种氨基酸进行衍生化反应，生成用紫外分光光度计在紫外光区250-255nm处进行检测的衍生化产物对乙酰氨基苯磺酰-氨基酸。
全文摘要
本发明公开了一种可以与蛋白质、氨基酸进行衍生化反应的新型标记试剂4－(N，N－二甲氨基)偶氮苯－4’－磺酰氟及其合成方法和该化合物在蛋白质、氨基酸分析中的应用，及其中间体对乙酰氨基苯磺酰氟的合成方法和该化合物在蛋白质、氨基酸分析中的应用。该标记试剂以苯胺为原料经过乙酰化、氯磺化和氟代反应制备对乙酰氨基苯磺酰氟，再把对乙酰氨基苯磺酰氟水解、经重氮化、偶合反应后制得。该标记试剂合成方便、易于保存、在温和条件下和一级或二级氨基酸进行衍生化反应、衍生化产物稳定、液相或毛细色谱分离方便和仪器响应值高、检测灵敏度达pmol级。达到化学衍生化—仪器检测的效果。
文档编号G01N33/58GK1776424SQ200510095680
公开日2006年5月24日 申请日期2005年11月28日 优先权日2005年11月28日
发明者李寿椿 申请人:李寿椿