丹磺酰氨基乙酸作为增强型汞离子荧光探针的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于荧光检测技术领域，涉及丹磺酰氨基乙酸作为增强型汞离子荧光探针 的应用。
【背景技术】
[0002] 汞离子是剧毒的重金属离子，能够对与新陈代谢相关的蛋白质、酶等产生破坏作 用，从而对生物细胞产生毒害；另外，汞离子还具有易迀移性、持久性、生物富集性，以及较 强的致癌性和致畸性。因此，研究高效、廉价、操作简便的汞离子检测手段具有重要意义。
[0003] 在众多检测方法中，荧光探针由于其具有选择性好、灵敏度高、抗干扰能力强、成 本低等特点而成为汞离子检测的重要手段。根据荧光信号的减弱或增强，汞离子荧光探针 可分为猝灭（turn-off)型和增强（turn-on)型；而根据探针母体的结构，汞离子荧光探针 又可分为氟硼二吡咯类、罗丹明类、萘酰亚胺类、芘类、蒽类和丹磺酰氯类等。丹磺酰氯类荧 光探针由于拥有较强的紫外吸收和荧光发射，灵敏度高，光稳定性好，并且可以在脱氯后连 接不同的识别基团，达到检测不同离子的效果，因此成为荧光探针中的一个重要类别。但 是，常见的用于检测汞离子的丹磺酰氯类荧光探针大多为猝灭型，即与汞离子发生作用后 自身荧光减弱或者猝灭，大大影响了实际检测效果。
[0004] 因此，研究并开发一种结构简单、易于合成、选择性好、灵敏度高的增强型汞离子 荧光探针及其相应的检测方法将具有重大的科研和经济价值。
【发明内容】
[0005] 针对上述情况，本发明的目的在于提供丹磺酰氨基乙酸作为增强型汞离子荧光探 针的应用及具体的检测方法。
[0006] 丹磺酰氨基乙酸（DNSG)，其化学名称为（5-二甲氨基萘-1-磺酰氨基）乙酸，英文 名称为（5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonamido) acetic acid，结构如式（I)所不， 其制备过程可以参考W0 2014/037394 A1中iP,裁的合成方法"
[0007] 在利用上述化合物检测汞离子时，其荧光信号容易被汞离子猝灭，造成检测灵敏 度过低的问题。鉴于此，本发明通过添加丝素蛋白（SF)的方法，使得丹磺酰氨基乙酸转化 成为具有高选择性和高灵敏度的增强型汞离子荧光探针。在向含有丝素蛋白的荧光探针溶 液中加入汞离子之后，探针结构中的叔氨基和丝素蛋白中的羧基可以结合一个汞离子，探 针结构中的羧基和丝素蛋白中的伯氨基也可以结合一个汞离子，溶剂中的水分子也可能参 与络合，从而引起荧光光谱发生变化，达到提高检测灵敏度的目的(如图1所示)。
[0008] 具体而言，本发明提供了一种利用丹磺酰氨基乙酸检测汞离子浓度的方法，其包 括如下步骤： 1) 配制标准溶液：分别向一系列具有不同汞离子浓度的HEPES缓冲液中加入丹磺酰氨 基乙酸和丝素蛋白，得到一系列标准溶液，其中各个标准溶液具有相同浓度的丹磺酰氨基 乙酸和相同浓度的丝素蛋白，并且丹磺酰氨基乙酸的浓度为1〇~30 yM，丝素蛋白的浓度为 0. 031-0. 317 g/L 2) 拟合线性方程：在相同的激发波长下，测定步骤1)中配制的各个标准溶液的荧光光 谱，确定各自的最大焚光强度，拟合最大焚光强度与萊离子浓度之间成直线关系部分的线 性方程； 3) 配制待测溶液：向汞离子浓度未知的待测样品中加入丹磺酰氨基乙酸和丝素蛋白， 并用HEPES缓冲液定容，得到待测溶液，其中丹磺酰氨基乙酸和丝素蛋白的浓度分别与步 骤1)中各自的浓度相同； 4) 计算汞离子浓度：在与步骤2)对应的激发波长下，测定步骤3)中配制的待测溶液 的荧光光谱并确定最大荧光强度，根据步骤2)中得到的线性方程计算待测样品中的汞离子 浓度。
[0009] 优选的，在上述方法中，步骤1)中所述汞离子浓度介于15~160 y M之间。
[0010] 优选的，在上述方法中，步骤1)中所述丹磺酰氨基乙酸的浓度为10 yM。
[0011] 优选的，在上述方法中，步骤1)中所述丝素蛋白的浓度为0.076 g/L。
[0012] 优选的，在上述方法中，步骤1)和3)中所述HEPES缓冲液中HEPES的浓度为20 mM，所述ffiPES缓冲液的pH值为6. 7。
[0013] 优选的，在上述方法中，步骤2)和4)中所述激发波长为330 nm。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有以下优势： (1) 本发明中所使用的DNSG荧光探针结构简单，合成容易； (2) 本发明中所使用的丝素蛋白无毒、价廉、易得； (3) 本发明的检测方法使用水基缓冲液（HEPES缓冲液）作为检测体系，不含任何有机 溶剂，环境友好，检测体系的pH值为6. 7,接近于中性，有利于在生态环境中应用； (4) 通过荧光强度和荧光波长两个通道识别汞离子，能够抵抗多种共存金属离子的干 扰，有效地提高了汞离子检测的选择性和灵敏度。
【附图说明】
[0015] 图1中显示了在丝素蛋白的参与下荧光探针对汞离子的响应机理。
[0016] 图2中显示了 DNSG探针浓度和丝素蛋白浓度对荧光增强倍数的影响。
[0017] 图3中显示了丝素蛋白浓度对DNSG探针检测汞离子的影响。
[0018] 图4中显示了 DNSG探针对汞离子的选择性。
[0019] 图5中显示了 DNSG探针的最大荧光强度与汞离子浓度的变化关系。
[0020] 图6中显示了 DNSG探针的荧光发射波长与汞离子浓度的变化关系。
[0021] 图7中显示了 DNSG探针检测汞离子时荧光强度的抗干扰性。
[0022] 图8中显示了 DNSG探针检测汞离子时荧光波长的抗干扰性。
[0023] 图9中显示了 DNSG探针检测汞离子的可逆性。
【具体实施方式】
[0024] 下面将参考附图和具体实施例对本发明做出进一步的说明。
[0025] 实施例一：DNSG探针的制备。
[0026] 称取丹磺酰氯（DNS) (0.2 g，0.74mmol)放入三口烧瓶中，加入4mL丙酮溶解， 再缓慢加入氨基乙酸（0.265 g，3. 53mmol)的碳酸氢钠（1.185 g，14. 11mmol)水溶液（14 mL)。搅拌条件下，滴加三乙胺（638 yL，4. 59mmol)至混合溶液中，溶液立刻由橙黄色变为 淡绿色，两小时后停止反应。通过硅胶柱色谱法纯化，得到丹磺酰氨基乙酸（DNSG)( 140 mg， 产率为61.0%)。^：-]^(聲/￡?):理论值 308.36 ((：141116队043)，实际值 309.09 (代表[]\1+扣 + 峰)。
[0027] 实施例二：利用DNSG探针检测样品中的汞离子浓度。
[0028] (1)配制11份含有DNSG探针和丝素蛋白的HEPES缓冲液（20 mM，pH=6. 7，10 mL)， 其中DNSG探针的浓度为10 yM，丝素蛋白的浓度为0.076 g/L。选取其中1份作为不添 加汞离子的空白溶液，向剩余的10份中依次滴加含有汞离子的浓溶液(保证滴加完毕后标 准溶液的体积不发生显著变化)，直至汞离子的浓度分别达到20、40、60、80、100、120、140、 160、180和200 y M，得到一系列标准溶液。
[0029] (2)在330 nm激发波长下，测定各个标准溶液的焚光光谱并确定各自的最大焚光 强度，以最大荧光强度对汞离子浓度作图，选取线性关系较好的部分，通过拟合得到线性方 程：y=778138. 22+1359. 38x (r=0. 98596)，其中y表示最大荧光强度，x表示汞离子浓度。
[0030] (3)向汞离子浓度未知的待测样品（1 mL)中加入DNSG探针和丝素蛋白，并用 HEPES缓冲液（20 mM，pH=6. 7)定容至10 mL，得到待测溶液，其中DNSG探针的浓度为10 yM，丝素蛋白的浓度为0.076 g/L。
[0031] (4)在330 nm激发波长下，测定待测溶液的荧光光谱并确定其最大荧光强度为 911493,根据步骤（2)中得到的线性方程（即最大荧光强度与汞离子浓度之间的函数关系） 计算出待测溶液中汞离子浓度为98. 09 yM。平行测定三次，取平均值得到待测样品中的汞 离子浓度。
[0032] 实施例三：DNSG探针和丝素蛋白的最佳浓度的确定。
[0033] 利用正交试验法优化探针和丝素蛋白浓度，选定的体系为HEPES缓冲溶液（20 mM，pH=6. 7)，因素水平表如表1所示。然后根据表1，制定正交表2进行实验。
[0034] 如表2所示，9组实验中以第2组实验的荧光增强倍数最高，相应的实验条件为探 针浓度10 yM，丝素蛋白浓度0.062 g/L，Hg2+浓度200 yM (AAA)。
[0035] 进一步将表2中的荧光增强倍数分别对探针和丝素蛋白浓度作图，其结果如图2 所示。从图2可以看出，探针浓度较低时荧光增强倍数较大，但是探针浓度从20 yM降至 10 yM，荧光增强倍数的增大趋势变缓，因此确定探针最佳浓度为10 yM。另外，图2中显 示出丝素蛋白浓度为0. 062 g/L时荧光增强倍数最大。
[0036] 实施例四：丝素蛋白浓度的进一步优化。
[0037] 固定DNSG探针的浓度为10 yM，考察丝素蛋白浓度对D